李居怡，劉巧媚，黃文靜，阮周瑩，鄧艾平

（1.武漢市中心醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢 430021；2.武漢市第三醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，湖北武漢 430061；3.武漢市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北武漢 430021；4.武漢市中心醫(yī)院眼科，湖北武漢 430021）

◇技術(shù)方法◇

適用于細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)

李居怡1，劉巧媚2，黃文靜3，阮周瑩4，鄧艾平1

（1.武漢市中心醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢 430021；2.武漢市第三醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，湖北武漢 430061；3.武漢市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北武漢 430021；4.武漢市中心醫(yī)院眼科，湖北武漢 430021）

目的 建立適用于細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白質(zhì)組的雙向電泳分離條件。方法 冷凍干燥法制備囊液總蛋白提取物，觀察不同的蛋白樣品處理方法、IPG膠條p H范圍和電泳上樣量對(duì)雙向電泳圖譜的影響。結(jié)果 經(jīng)ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit處理的提取物上樣量為400μg，在p H7～10范圍的膠條進(jìn)行雙向電泳分離，可獲取蛋白斑點(diǎn)較多、重復(fù)性較好的二維電泳圖譜。結(jié)論 建立的細(xì)粒棘球蚴囊液雙向電泳技術(shù)及圖譜，可為細(xì)粒棘球蚴蟲蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供理論依據(jù)。

細(xì)粒棘球蚴；囊液；蛋白質(zhì)組學(xué)；雙向電泳

細(xì)粒棘球蚴?。倚桶x?。┦怯杉?xì)粒棘球絳蟲幼蟲引起的一種人畜共患寄生蟲病，該病呈世界性分布［1］。我國是細(xì)粒棘球蚴病發(fā)病率最高的國家之一，尤其在畜牧業(yè)高度發(fā)達(dá)的西北地區(qū)，包蟲病已成為高發(fā)性地方?。?］。包蟲病在西北地區(qū)的廣泛流行，嚴(yán)重地危害當(dāng)?shù)貜V大人民群眾的健康水平，并在一定程度上制約了當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的發(fā)展。因此，包蟲病的早期預(yù)防、早期診斷將為提高廣大人民群眾的生活質(zhì)量產(chǎn)生積極的意義，而尋找包蟲病有診斷價(jià)值的抗原是目前包蟲病防治的熱點(diǎn)之一。

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)——雙向電泳技術(shù)，第一向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開，樣品中的蛋白經(jīng)過2次垂直方向上的分離，其結(jié)果可為一張擁有近千個(gè)蛋白點(diǎn)的“繁星圖”，利用計(jì)算機(jī)軟件的分析，基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOE-MS）以及氨基酸分析等鑒定技術(shù)［3］，從大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白

相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生、細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識(shí)。我們以細(xì)粒棘球蚴囊液為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行雙向電泳技術(shù)的建立和條件優(yōu)化，以期能為細(xì)粒棘球蚴蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，并為包蟲病有診斷價(jià)值抗原的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料細(xì)粒棘球蚴囊液的收集：從寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院包蟲病患者手術(shù)摘除的完整包囊，無菌條件下抽取囊液，于凍干機(jī)凍成粉末，-85℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)粒棘球蚴囊液總蛋白的提取與處理 取細(xì)粒棘球蚴囊液凍干粉末5 mg，加入預(yù)冷的裂解液［9 mol/L尿素，0.065 mol/L 3-（3-cholamidopropyl）dimethyl-ammonio-1-propane sulfonate（CHAPS），0.065 mol/L dithiothreitol（DTT），0.021 mol/L protease inhibitor cocktail］，充分振蕩混勻，于4℃放置1 h，再以12 000×g、4℃離心30 min，收集上清液，保存于-85℃?zhèn)溆茫鞍诐舛葴y(cè)定采用Bradford［4］法。

TCA-丙酮沉淀法［5］處理提取物：取上述400μL上清液加入等體積預(yù)冷的1.22 mol/L TCA/丙酮，-20℃沉淀過夜，12 000×g、4℃離心15 min，收集沉淀，沉淀用預(yù)冷的丙酮（含0.020 mol/L DTT，適量protease inhibitor cocktail）重懸，-20℃靜置30 min，14 000×g、4℃離心15 min，棄上清，所得沉淀加入200μL樣品水化液［8 mol/L尿素，0.065 mol/L CHAPS，0.065 mol/L DTT，0.003 mol/L Bio-Lyte（p H：3-10），0.15×10-5mol/L溴酚藍(lán)］，保存于-85℃，蛋白濃度測(cè)定采用Bradford法。

ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit（除鹽試劑盒）處理提取物，參照BIO-RAD公司ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit說明書逐步對(duì)提取物進(jìn)行處理，最后在樣品的沉淀中加入400μL樣品水化液，保存于-85℃，蛋白濃度測(cè)定采用Bradford法。

圖1 細(xì)粒棘球蚴囊液樣品的不同處理方法的比較Eig.1 Comparison of hydatid-cyst fluid protein extracted by different extraction methods from Echinococcus granulosus

AurumTMSerum Protein Mini Kit（除高峰度蛋白試劑盒）處理提取物，參照BIO-RAD公司AurumTMSerum Protein Mini Kit說明書逐步對(duì)提取物進(jìn)行處理，對(duì)所得上清液蛋白采用Bradford法測(cè)定其蛋白濃度。

1.2.2 雙向電泳 取上述蛋白處理后的蛋白溶液200μL，將預(yù)制冷凍在-20℃保存的immobilized p H gradient（IPG）膠條（p H：3～10，7 cm；p H：7～10，7 cm）在室溫放置10 min。第一向等電聚焦采用下列參數(shù)：主動(dòng)水化50 V 12 h（20℃）；Step1 250 V線性30 min；Step2 500 V快速30 min；Step3 4 000 V線性3 h；Step4 4 000 V快速20 000 Vh；Step5 500 V快速任意時(shí)間。聚焦電泳完畢，膠條在平衡液I（6 mol/L尿素、0.375 mol/L Tris-HCl（p H 8.8）、2.17 mol/L甘油、0.069 mol/L SDS、0.13 mol/L DTT）中振蕩平衡15 min，再換平衡液Ⅱ（6 mol/L尿素、0.375 mol/L Tris-HCl（p H8.8）、2.17 mol/L甘油、0.069 mol/L SDS、0.135 mol/L碘乙酰胺）振蕩平衡15 min。平衡后的膠條放入0.52 mol/L的SDS-PAGE中電泳，待溴酚藍(lán)指示到達(dá)凝膠邊緣時(shí)結(jié)束電泳。

1.2.3 凝膠染色與圖像分析 凝膠采用考馬斯亮藍(lán)法染色，采用GS-800 Calibrated Densitometer投射掃描2-DE凝膠，用PDQuest 8.0 2D Analysis Software對(duì)所得圖像進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)粒棘球蚴囊液樣品的不同處理方法的比較提取的樣品未經(jīng)任何處理，經(jīng)雙向電泳分離（樣品處理方法的比較均用p H 3～10膠條，蛋白取樣量為400μg）后，蛋白聚集明顯，點(diǎn)與點(diǎn)之間沒有界限（圖1A）。經(jīng)ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit處理后的樣品，蛋白斑點(diǎn)較圖A清晰很多，條紋明顯減少（圖1B）。經(jīng)AurumTMSerum Protein Mini Kit處理后的樣品，圖上幾乎沒有蛋白斑點(diǎn)（圖1C）。經(jīng)TCA-丙酮沉淀法處理的樣品，單個(gè)蛋白斑點(diǎn)明顯增多（圖1D）。

2.2 不同p H范圍膠條的比較由圖1可見，蛋白斑點(diǎn)主要集中在膠的上方堿性區(qū)域，在膠的酸性端有很大空白。故分別以p H 3～10與p H 7～10膠條進(jìn)行雙向電泳，比較二者對(duì)囊液蛋白提取物蛋白的分離效果。結(jié)果顯示，p H 7～10膠條分離囊液聚集蛋白的效果好于p H 3～10（圖2）。

圖2 細(xì)粒棘球蚴囊液樣品的不同p H范圍膠條等電聚焦的比較Eig.2 Comparison of hydatid-cyst fluid protein with different p H range of IPG strip from Echinococcus granulosus

2.3 不同樣品上樣量的比較圖3中，在p H 7～10的膠條范圍，圖3C（400μg）上樣量是圖3B（200μg）的2倍，蛋白的斑點(diǎn)總數(shù)明顯多于圖3B，但是不足的是在p H 8位置的蛋白聚集比圖3B嚴(yán)重。在p H 3～10的膠條范圍，圖3A（400μg）上樣量是圖3E（800μg）的1/2，是圖3D的2倍，圖3A較圖3D（200μg）蛋白斑點(diǎn)清晰很多，而較圖3E少了一些蛋白斑點(diǎn)，提示囊液中有些蛋白量非常小。

3 討 論

雙向電泳技術(shù)是目前分離組分復(fù)雜的組織總蛋白的最有效技術(shù)，也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)之一。雙向電泳圖譜的高分辨率、高重復(fù)性是準(zhǔn)確分析鑒定細(xì)粒棘球蚴蟲相關(guān)蛋白的必備條件。本研究對(duì)蛋白樣品處理方法、電泳上樣量和IPG膠條p H范圍進(jìn)行了一系列改進(jìn)與優(yōu)化，獲得了蛋白斑點(diǎn)數(shù)目較多而且較清晰的圖譜，能滿足后期的質(zhì)譜分析。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，用電泳方法分析人體棘球蚴液，其中44%為白蛋白，39%為α-球蛋白及β-球蛋白，17%為γ-球蛋白，棘球蚴液中的蛋白質(zhì)具有抗原性［6］。本研究通過采用不同的方法對(duì)提取物進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)棘球蚴液大部分蛋白集中在分子質(zhì)量60 ku左右、p H在8左右，通過AurumTMSerum Protein Mini Kit處理后發(fā)現(xiàn)，凝膠圖上幾乎沒有蛋白斑點(diǎn)。提示，在除高峰度蛋白的同時(shí)把其他的蛋白一并除去，在建立細(xì)粒棘球蚴囊液雙向電泳圖譜時(shí)，不建議采用除高峰度蛋白試劑盒。通過p H 3～10與p H 7～10兩種膠條做等電聚焦后發(fā)現(xiàn)，樣品中的蛋白主要在堿性區(qū)域，用p H 7～10膠條分離蛋白的效果更好，得到的單個(gè)蛋白斑點(diǎn)更多。而上樣量的差異顯示，蛋白的上樣量越大，得到的蛋白斑點(diǎn)相應(yīng)較多，然而，白蛋白、球蛋白的聚集就會(huì)相應(yīng)地密集，難以辨別，提示樣品中的有些蛋白量很小，常規(guī)上樣量很難能辨別它們。

圖3 細(xì)粒棘球蚴囊液不同樣品上樣量的比較Eig.3 Comparison of hydatid-cyst fluid protein with different loading amount from Echinococcus granulosus

ROTT等［7］研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)粒棘球絳蟲抗原B（Eg AgB）是細(xì)粒棘球蚴囊液的一種主要抗原成分，是大分子熱穩(wěn)定脂蛋白；Eg AgB是常用的診斷細(xì)粒棘球蚴病的抗原，有較高的特異性和確診率［8］。本研究試圖建立細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白質(zhì)組的雙向電泳圖譜，為后期質(zhì)譜鑒定做好基礎(chǔ)工作，為質(zhì)譜技術(shù)鑒定出囊液中的各種蛋白、尋找有價(jià)值的診斷抗原提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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［3］蘭彥，柳正良，錢小紅.蛋白質(zhì)組學(xué)—開辟21世紀(jì)藥物研究的新思路［J］.國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè)，2000，27（3）：129-133.

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（編輯 卓選鵬）

Two-dimensional electrophoresis for proteomics analysis of hydatid fluid of the Echinococcus granulosus

LI Ju-yi1，LIU Qiao-mei2，HUANG Wen-jing3，RUAN Zhou-ying4，DENG Ai-ping1
（1.Department of Pharmacy，the Central Hospital of Wuhan，Wuhan 430021；2.Medical Department，the Third Hospital of Wuhan，Wuhan 430061；3.Department of Endocrinology，the Central Hospital of Wuhan，Wuhan 430021；4.Department of Ophthalmology，the Central Hospital of Wuhan，Wuhan 430021）

Objective To establish two-dimensional electrophoresis（2-DE）technology for hydatid fluid of the parasiteEchinococcus granulosus.Methods We extracted total proteins ofEchinococcus granulosusby lyophilization and studied the changes of 2-DE picture under different methods of dealing with the protein samples，p H range of IPG strip and quantitative loading of the samples.Results The two-dimensional collection of illustrative plate with better resolution and repetition was achieved when the hydatid fluid dealt with ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit was analyzed using 400μg of quantitative loading and IPG strips p H 7-10.Conclusion The established 2-DE method and maps of hydatid fluid of the parasiteEchinococcus granulosuscan provide theoretical evidence for proteomic study ofEchinococcus granulosus.

Echinococcus granulosus；hydatid fluid；proteome；two-dimensional electrophoresis

R183.4

A

10.7652/jdyxb201505027

2014-09-28

2015-02-24

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.30960360）；武漢市臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（No.WX11A02，WZ15D19）Supported by the National Natural Science Eoundation of China（No.30960360）；Wuhan Clinical Medical Research Project（No. WX11A02，WZ15D19）

鄧艾平.E-mail：187076605@qq.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150817.1537.004.html（2015-08-17）