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        適用于細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)

        2015-06-23 16:28:29李居怡劉巧媚黃文靜阮周瑩鄧艾平
        關(guān)鍵詞:雙向電泳膠條樣量

        李居怡,劉巧媚,黃文靜,阮周瑩,鄧艾平

        (1.武漢市中心醫(yī)院藥學(xué)部,湖北武漢 430021;2.武漢市第三醫(yī)院醫(yī)務(wù)處,湖北武漢 430061;3.武漢市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科,湖北武漢 430021;4.武漢市中心醫(yī)院眼科,湖北武漢 430021)

        ◇技術(shù)方法◇

        適用于細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)

        李居怡1,劉巧媚2,黃文靜3,阮周瑩4,鄧艾平1

        (1.武漢市中心醫(yī)院藥學(xué)部,湖北武漢 430021;2.武漢市第三醫(yī)院醫(yī)務(wù)處,湖北武漢 430061;3.武漢市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科,湖北武漢 430021;4.武漢市中心醫(yī)院眼科,湖北武漢 430021)

        目的 建立適用于細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白質(zhì)組的雙向電泳分離條件。方法 冷凍干燥法制備囊液總蛋白提取物,觀察不同的蛋白樣品處理方法、IPG膠條p H范圍和電泳上樣量對(duì)雙向電泳圖譜的影響。結(jié)果 經(jīng)ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit處理的提取物上樣量為400μg,在p H7~10范圍的膠條進(jìn)行雙向電泳分離,可獲取蛋白斑點(diǎn)較多、重復(fù)性較好的二維電泳圖譜。結(jié)論 建立的細(xì)粒棘球蚴囊液雙向電泳技術(shù)及圖譜,可為細(xì)粒棘球蚴蟲蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供理論依據(jù)。

        細(xì)粒棘球蚴;囊液;蛋白質(zhì)組學(xué);雙向電泳

        細(xì)粒棘球蚴?。倚桶x?。┦怯杉?xì)粒棘球絳蟲幼蟲引起的一種人畜共患寄生蟲病,該病呈世界性分布[1]。我國是細(xì)粒棘球蚴病發(fā)病率最高的國家之一,尤其在畜牧業(yè)高度發(fā)達(dá)的西北地區(qū),包蟲病已成為高發(fā)性地方?。?]。包蟲病在西北地區(qū)的廣泛流行,嚴(yán)重地危害當(dāng)?shù)貜V大人民群眾的健康水平,并在一定程度上制約了當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的發(fā)展。因此,包蟲病的早期預(yù)防、早期診斷將為提高廣大人民群眾的生活質(zhì)量產(chǎn)生積極的意義,而尋找包蟲病有診斷價(jià)值的抗原是目前包蟲病防治的熱點(diǎn)之一。

        目前,蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)——雙向電泳技術(shù),第一向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同用等電聚焦分離,第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離,把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開,樣品中的蛋白經(jīng)過2次垂直方向上的分離,其結(jié)果可為一張擁有近千個(gè)蛋白點(diǎn)的“繁星圖”,利用計(jì)算機(jī)軟件的分析,基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOE-MS)以及氨基酸分析等鑒定技術(shù)[3],從大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征,包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白

        相互作用等,由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生、細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識(shí)。我們以細(xì)粒棘球蚴囊液為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行雙向電泳技術(shù)的建立和條件優(yōu)化,以期能為細(xì)粒棘球蚴蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ),并為包蟲病有診斷價(jià)值抗原的研究奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料細(xì)粒棘球蚴囊液的收集:從寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院包蟲病患者手術(shù)摘除的完整包囊,無菌條件下抽取囊液,于凍干機(jī)凍成粉末,-85℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)粒棘球蚴囊液總蛋白的提取與處理 取細(xì)粒棘球蚴囊液凍干粉末5 mg,加入預(yù)冷的裂解液[9 mol/L尿素,0.065 mol/L 3-(3-cholamidopropyl)dimethyl-ammonio-1-propane sulfonate(CHAPS),0.065 mol/L dithiothreitol(DTT),0.021 mol/L protease inhibitor cocktail],充分振蕩混勻,于4℃放置1 h,再以12 000×g、4℃離心30 min,收集上清液,保存于-85℃?zhèn)溆茫鞍诐舛葴y(cè)定采用Bradford[4]法。

        TCA-丙酮沉淀法[5]處理提取物:取上述400μL上清液加入等體積預(yù)冷的1.22 mol/L TCA/丙酮,-20℃沉淀過夜,12 000×g、4℃離心15 min,收集沉淀,沉淀用預(yù)冷的丙酮(含0.020 mol/L DTT,適量protease inhibitor cocktail)重懸,-20℃靜置30 min,14 000×g、4℃離心15 min,棄上清,所得沉淀加入200μL樣品水化液[8 mol/L尿素,0.065 mol/L CHAPS,0.065 mol/L DTT,0.003 mol/L Bio-Lyte(p H:3-10),0.15×10-5mol/L溴酚藍(lán)],保存于-85℃,蛋白濃度測(cè)定采用Bradford法。

        ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit(除鹽試劑盒)處理提取物,參照BIO-RAD公司ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit說明書逐步對(duì)提取物進(jìn)行處理,最后在樣品的沉淀中加入400μL樣品水化液,保存于-85℃,蛋白濃度測(cè)定采用Bradford法。

        圖1 細(xì)粒棘球蚴囊液樣品的不同處理方法的比較Eig.1 Comparison of hydatid-cyst fluid protein extracted by different extraction methods from Echinococcus granulosus

        AurumTMSerum Protein Mini Kit(除高峰度蛋白試劑盒)處理提取物,參照BIO-RAD公司AurumTMSerum Protein Mini Kit說明書逐步對(duì)提取物進(jìn)行處理,對(duì)所得上清液蛋白采用Bradford法測(cè)定其蛋白濃度。

        1.2.2 雙向電泳 取上述蛋白處理后的蛋白溶液200μL,將預(yù)制冷凍在-20℃保存的immobilized p H gradient(IPG)膠條(p H:3~10,7 cm;p H:7~10,7 cm)在室溫放置10 min。第一向等電聚焦采用下列參數(shù):主動(dòng)水化50 V 12 h(20℃);Step1 250 V線性30 min;Step2 500 V快速30 min;Step3 4 000 V線性3 h;Step4 4 000 V快速20 000 Vh;Step5 500 V快速任意時(shí)間。聚焦電泳完畢,膠條在平衡液I(6 mol/L尿素、0.375 mol/L Tris-HCl(p H 8.8)、2.17 mol/L甘油、0.069 mol/L SDS、0.13 mol/L DTT)中振蕩平衡15 min,再換平衡液Ⅱ(6 mol/L尿素、0.375 mol/L Tris-HCl(p H8.8)、2.17 mol/L甘油、0.069 mol/L SDS、0.135 mol/L碘乙酰胺)振蕩平衡15 min。平衡后的膠條放入0.52 mol/L的SDS-PAGE中電泳,待溴酚藍(lán)指示到達(dá)凝膠邊緣時(shí)結(jié)束電泳。

        1.2.3 凝膠染色與圖像分析 凝膠采用考馬斯亮藍(lán)法染色,采用GS-800 Calibrated Densitometer投射掃描2-DE凝膠,用PDQuest 8.0 2D Analysis Software對(duì)所得圖像進(jìn)行分析。

        2 結(jié) 果

        2.1 細(xì)粒棘球蚴囊液樣品的不同處理方法的比較提取的樣品未經(jīng)任何處理,經(jīng)雙向電泳分離(樣品處理方法的比較均用p H 3~10膠條,蛋白取樣量為400μg)后,蛋白聚集明顯,點(diǎn)與點(diǎn)之間沒有界限(圖1A)。經(jīng)ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit處理后的樣品,蛋白斑點(diǎn)較圖A清晰很多,條紋明顯減少(圖1B)。經(jīng)AurumTMSerum Protein Mini Kit處理后的樣品,圖上幾乎沒有蛋白斑點(diǎn)(圖1C)。經(jīng)TCA-丙酮沉淀法處理的樣品,單個(gè)蛋白斑點(diǎn)明顯增多(圖1D)。

        2.2 不同p H范圍膠條的比較由圖1可見,蛋白斑點(diǎn)主要集中在膠的上方堿性區(qū)域,在膠的酸性端有很大空白。故分別以p H 3~10與p H 7~10膠條進(jìn)行雙向電泳,比較二者對(duì)囊液蛋白提取物蛋白的分離效果。結(jié)果顯示,p H 7~10膠條分離囊液聚集蛋白的效果好于p H 3~10(圖2)。

        圖2 細(xì)粒棘球蚴囊液樣品的不同p H范圍膠條等電聚焦的比較Eig.2 Comparison of hydatid-cyst fluid protein with different p H range of IPG strip from Echinococcus granulosus

        2.3 不同樣品上樣量的比較圖3中,在p H 7~10的膠條范圍,圖3C(400μg)上樣量是圖3B(200μg)的2倍,蛋白的斑點(diǎn)總數(shù)明顯多于圖3B,但是不足的是在p H 8位置的蛋白聚集比圖3B嚴(yán)重。在p H 3~10的膠條范圍,圖3A(400μg)上樣量是圖3E(800μg)的1/2,是圖3D的2倍,圖3A較圖3D(200μg)蛋白斑點(diǎn)清晰很多,而較圖3E少了一些蛋白斑點(diǎn),提示囊液中有些蛋白量非常小。

        3 討 論

        雙向電泳技術(shù)是目前分離組分復(fù)雜的組織總蛋白的最有效技術(shù),也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)之一。雙向電泳圖譜的高分辨率、高重復(fù)性是準(zhǔn)確分析鑒定細(xì)粒棘球蚴蟲相關(guān)蛋白的必備條件。本研究對(duì)蛋白樣品處理方法、電泳上樣量和IPG膠條p H范圍進(jìn)行了一系列改進(jìn)與優(yōu)化,獲得了蛋白斑點(diǎn)數(shù)目較多而且較清晰的圖譜,能滿足后期的質(zhì)譜分析。

        有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),用電泳方法分析人體棘球蚴液,其中44%為白蛋白,39%為α-球蛋白及β-球蛋白,17%為γ-球蛋白,棘球蚴液中的蛋白質(zhì)具有抗原性[6]。本研究通過采用不同的方法對(duì)提取物進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)棘球蚴液大部分蛋白集中在分子質(zhì)量60 ku左右、p H在8左右,通過AurumTMSerum Protein Mini Kit處理后發(fā)現(xiàn),凝膠圖上幾乎沒有蛋白斑點(diǎn)。提示,在除高峰度蛋白的同時(shí)把其他的蛋白一并除去,在建立細(xì)粒棘球蚴囊液雙向電泳圖譜時(shí),不建議采用除高峰度蛋白試劑盒。通過p H 3~10與p H 7~10兩種膠條做等電聚焦后發(fā)現(xiàn),樣品中的蛋白主要在堿性區(qū)域,用p H 7~10膠條分離蛋白的效果更好,得到的單個(gè)蛋白斑點(diǎn)更多。而上樣量的差異顯示,蛋白的上樣量越大,得到的蛋白斑點(diǎn)相應(yīng)較多,然而,白蛋白、球蛋白的聚集就會(huì)相應(yīng)地密集,難以辨別,提示樣品中的有些蛋白量很小,常規(guī)上樣量很難能辨別它們。

        圖3 細(xì)粒棘球蚴囊液不同樣品上樣量的比較Eig.3 Comparison of hydatid-cyst fluid protein with different loading amount from Echinococcus granulosus

        ROTT等[7]研究發(fā)現(xiàn),細(xì)粒棘球絳蟲抗原B(Eg AgB)是細(xì)粒棘球蚴囊液的一種主要抗原成分,是大分子熱穩(wěn)定脂蛋白;Eg AgB是常用的診斷細(xì)粒棘球蚴病的抗原,有較高的特異性和確診率[8]。本研究試圖建立細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白質(zhì)組的雙向電泳圖譜,為后期質(zhì)譜鑒定做好基礎(chǔ)工作,為質(zhì)譜技術(shù)鑒定出囊液中的各種蛋白、尋找有價(jià)值的診斷抗原提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

        [1]MCMANUS DP,ZHANG W,LI J,et al.Echinococcosis[J]. Lancet,2003,362(9392):1295-304.

        [2]CRAIG PS.Epidemiology of human alveolar echinococcosis in China[J].Parasitol Int,2006,55:221-225.

        [3]蘭彥,柳正良,錢小紅.蛋白質(zhì)組學(xué)—開辟21世紀(jì)藥物研究的新思路[J].國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè),2000,27(3):129-133.

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        [5]CILIA M,F(xiàn)ISH T,YANG X,et al.A comparison of protein extraction methods suitable for gel-based proteomic studies of aphid proteins[J].J Biomol Tech,2009,20(4):201-15.

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        [8]GONZA LG,LORENZO C,NIETO A.Improved immunodiagnosis of cystic hydatid disease by using a synthetic peptide with higher diagnostic value than that of its parent protein,Echinococcus granulosus antigen B[J].J Clin Microbiol,2000,38(11):3979-3983.

        (編輯 卓選鵬)

        Two-dimensional electrophoresis for proteomics analysis of hydatid fluid of the Echinococcus granulosus

        LI Ju-yi1,LIU Qiao-mei2,HUANG Wen-jing3,RUAN Zhou-ying4,DENG Ai-ping1
        (1.Department of Pharmacy,the Central Hospital of Wuhan,Wuhan 430021;2.Medical Department,the Third Hospital of Wuhan,Wuhan 430061;3.Department of Endocrinology,the Central Hospital of Wuhan,Wuhan 430021;4.Department of Ophthalmology,the Central Hospital of Wuhan,Wuhan 430021)

        Objective To establish two-dimensional electrophoresis(2-DE)technology for hydatid fluid of the parasiteEchinococcus granulosus.Methods We extracted total proteins ofEchinococcus granulosusby lyophilization and studied the changes of 2-DE picture under different methods of dealing with the protein samples,p H range of IPG strip and quantitative loading of the samples.Results The two-dimensional collection of illustrative plate with better resolution and repetition was achieved when the hydatid fluid dealt with ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit was analyzed using 400μg of quantitative loading and IPG strips p H 7-10.Conclusion The established 2-DE method and maps of hydatid fluid of the parasiteEchinococcus granulosuscan provide theoretical evidence for proteomic study ofEchinococcus granulosus.

        Echinococcus granulosus;hydatid fluid;proteome;two-dimensional electrophoresis

        R183.4

        A

        10.7652/jdyxb201505027

        2014-09-28

        2015-02-24

        國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30960360);武漢市臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(No.WX11A02,WZ15D19)Supported by the National Natural Science Eoundation of China(No.30960360);Wuhan Clinical Medical Research Project(No. WX11A02,WZ15D19)

        鄧艾平.E-mail:187076605@qq.com

        優(yōu)先出版:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150817.1537.004.html(2015-08-17)

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