高 燁，李曉青，吳夢茹，梁 歡

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院急診科，陜西西安 710061）

百草枯促進肺間質(zhì)細胞增殖依賴上皮細胞TGF-β信號

高 燁，李曉青，吳夢茹，梁 歡

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院急診科，陜西西安 710061）

目的 觀察百草枯（Paraquat，PQ）誘導(dǎo)人肺間質(zhì)成纖維細胞HEL299纖維化增殖過程中肺上皮細胞的重要作用及其調(diào)節(jié)的信號機制。方法 應(yīng)用體外人肺上皮細胞和間質(zhì)細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，MTT法檢測PQ對人肺間質(zhì)成纖維細胞HEL299和HPAEpiC細胞增殖的影響，ELISA檢測共培養(yǎng)體系中轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGE-β）變化，Real-time PCR和Western blot檢測上皮HPAEpiC細胞的TGE-β信號通路變化對肺間質(zhì)成纖維細胞HEL299增殖的影響。結(jié)果 PQ對肺間質(zhì)成纖維細胞HEL299體外增殖依賴于上皮細胞的存在。PQ促進肺上皮HPAEpiC細胞TGE-β的分泌，進而促進肺間質(zhì)成纖維細胞增殖；阻斷上皮細胞TGE-β信號將明顯減少間質(zhì)HEL299細胞的增殖。結(jié)論 PQ促進人肺間質(zhì)細胞上皮HEL299的增殖依賴微環(huán)境中上皮HPAEpiC細胞的TGE-β信號。本研究結(jié)果闡述了PQ誘導(dǎo)肺纖維化的一種新機制。

百草枯；肺纖維化；轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGE-β）

百草枯（paraquat，PQ）是一種高效的除草劑，在世界范圍內(nèi)廣泛使用。我國的PQ中毒發(fā)病率不斷增加，死亡率近100%，主要的發(fā)病機制是誘導(dǎo)肺纖維化，進而呼吸衰竭死亡，目前缺乏有效措施，主要是其發(fā)病分子機制不清楚［1-2］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，PQ可以誘導(dǎo)肺上皮細胞發(fā)生“EMT”樣改變，主要通過上皮細胞自分泌TGE-β信號調(diào)控［3］。本研究從細胞微環(huán)境角度證實PQ可誘導(dǎo)肺間質(zhì)細胞纖維化依賴于上皮細胞的TGE-β信號通路，阻斷上皮細胞的TGE-β信號通路將明顯抑制間質(zhì)細胞增殖，提示上皮細胞TGE-β信號可能是PQ中毒的潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肺上皮細胞株HPAEpiC和肺間質(zhì)成纖維細胞HEL299購自美國ATCC。

1.1.2 主要試劑 百草枯（Sigma公司）；DMEM（高糖型，Gibco公司）；新生胎牛血清（杭州四季青生物技術(shù)公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；ELISA試劑盒（上海伊科賽公司）；總RNA快速提取試劑盒（East 200，Eastagen Biotech）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（fermentas，MBI公司）；引物由北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成；TGE-β肽由美國Pharmingen公司合成；檢測及中和抗體購自ABCM公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺上皮HPAEpiC細胞和肺間質(zhì)成纖維細胞HEL299用含有100 m L/L胎牛血清（ECS）的DMEM、100 U/m L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM，在50 m L/L CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖 2×103人肺上皮HPAEpiC細胞和（或）肺間質(zhì)成纖維細胞HEL299接種于96孔板，24 h細胞貼壁后，加入不同濃度的（400、200、100、50、10、0μmol/L）PQ溶液，每個組設(shè)3個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，各孔加入20μg的MTT溶液（5 g/L），置37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，再加入150μg二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，靜置后在酶聯(lián)儀上選擇檢測波長490 nm比色測定各孔的吸光度（A值）。

1.2.3 共培養(yǎng)體系 體外人肺上皮和間質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系使用4μm孔直徑Transwell系統(tǒng)。1×103人肺上皮HPAEpiC細胞接種于Transwell上室中，同時5×103肺間質(zhì)細胞接種Transwell下室內(nèi)。使用SiRNA或中和抗體阻斷上皮HPAEpiC細胞TGE-β信號，培養(yǎng)體系中加入100μmol/L PQ，37℃、50 m L/L CO2孵箱孵育48 h后移去上室，檢測下室肺間質(zhì)細胞生長，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.4 ELISA法檢測共培養(yǎng)體系上清液中TGE-β含量 1×103人肺上皮HPAEpiC細胞接種于24孔板或者Transwell上室中，或5×103肺間質(zhì)細胞接種Transwell下室內(nèi)，按照100μmol/L的PQ處理細胞培養(yǎng)48 h后，收集細胞上清液，檢測各組細胞上清液中TGE-β含量。每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.5 Real-time PCR檢測細胞TGE-βm RNA表達 取對數(shù)生長期人肺上皮HPAEpiC細胞，調(diào)整細胞密度為5×104接種于6孔板，PQ終濃度為100 μmol/L，37℃、50 m L/L CO2孵箱孵育48 h。實驗重復(fù)3次。按照試劑盒操作要求，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)及PCR擴增，即1μg總RNA，使用SuperscriptⅢ酶進行逆轉(zhuǎn)錄。實時定量PCR反應(yīng)使用Bio-Rad公司CEX96系統(tǒng)，以目的基因mRNA/β-actin mRNA比值來表示mRNA的相對表達。

1.2.6 Western blot檢測細胞目的蛋白表達 胞裂解使用RIPA緩沖液（Tris-CL 7.4，150 mmol/L NaCl，10 m L/L Triton X-100，10 m L/L sodium deoxycholate，10 m L/L SDS）。20μg蛋白樣品分別上樣到8%～12%的SDS/PAGE分離凝膠上，然后轉(zhuǎn)移到PVDE膜上。50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入特異性一抗4℃過夜。PBS-T洗滌3次后，加入HRP偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h，用ECL系統(tǒng)檢測TGE-β蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 10統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間差異應(yīng)用Student-t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PQ對人間質(zhì)細胞增殖依賴上皮細胞我們首先檢測了PQ對肺間質(zhì)HEL299細胞增殖的影響。以不同濃度PQ和HEL299細胞孵育，在不同孵育時間點收集細胞，使用MTT法檢測PQ對肺上皮細胞的增殖影響。結(jié)果如圖1A所示，PQ誘導(dǎo)間質(zhì)細胞死亡呈現(xiàn)劑量和時間依賴性關(guān)系，在第3天不同濃度之間進行t檢驗分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PQ抑制HEL299細胞的IC50值為210.3μmol/L（圖1B），結(jié)合IC50和生長曲線，我們確定100μmol/L PQ用于后續(xù)實驗研究。

2.2 PQ增加人肺間質(zhì)細胞體外增殖能力依賴于上皮細胞存在我們既往研究證實，模擬體內(nèi)PQ中毒過程證實100μmol/L PQ與HPAEpiC細胞孵育24 h，可使肺上皮細胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變。本研究應(yīng)用體外共培養(yǎng)系統(tǒng)（圖2A），結(jié)果顯示，與對照空白細胞相比較，PQ可明顯增加肺間質(zhì)HEL299細胞體外增殖能力（圖2B），在第3天兩組間進行t檢驗分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PQ處理人肺間質(zhì)細胞的增殖可能依賴于上皮細胞分泌的存在。

2.3 PQ誘導(dǎo)人肺間質(zhì)細胞增殖依賴于上皮細胞TGF-β信號既然PQ誘導(dǎo)肺間質(zhì)細胞增殖依賴于上皮細胞的存在，那么上皮細胞是通過何種信號來調(diào)節(jié)間質(zhì)細胞增殖。體外的結(jié)果顯示，不同劑量的PQ可誘導(dǎo)肺上皮TGE-β分泌量增加（圖3A），在0、50、75、100μmol/L濃度之間進行t檢驗分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。我們模擬體內(nèi)濃度，在HEL299細胞加入100μmol/L PQ和（或）2μg/L TGE-β合成肽，體外生長實驗結(jié)果顯示，與DMSO對照細胞相比，TGE-β可以促進PQ誘導(dǎo)的肺間質(zhì)細胞體外增殖（圖3B、3C），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示PQ誘導(dǎo)肺間質(zhì)細胞增殖依賴于上皮細胞的TGE-β信號的活化。

圖1 MTT法檢測PQ對HEL299細胞增殖的影響Eig.1 The growth of HEL299 cells was determined by MTT assay

圖2 PQ促進人肺間質(zhì)細胞增殖依賴上皮細胞HPAEpiC存在Eig.2 Promotion of human lung stroma cell HEL 299 growth by PQ depended on the existence of epithelial HPAEpiC cells

圖3 PQ增加HPAEpiC細胞分泌TGF-β，進而促進肺間質(zhì)細胞HEL299的增殖Eig.3 PQ could increase HEL 299 cell growth via the secretion of TGE-βby HPAEpiC cells

2.4 阻斷上皮細胞TGF-β信號通路將抑制PQ誘導(dǎo)人肺間質(zhì)細胞增殖如上述結(jié)果所示，PQ可以誘導(dǎo)肺間質(zhì)細胞增生依賴于上皮細胞TGE-β信號活化，那么抑制肺上皮細胞TGE-β信號是否可以逆轉(zhuǎn)PQ誘導(dǎo)的間質(zhì)增生。如圖4A所示，應(yīng)用體外上皮和間質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系，應(yīng)用siRNA敲除上皮細胞TGE-β或特異性中和抗體中和共培養(yǎng)體系TGE-β信號（圖4B上圖Q-PCR，下圖Western blot），與對照組比較，可明顯逆轉(zhuǎn)PQ誘導(dǎo)的肺間質(zhì)HEL299細胞增殖（圖4C），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示特異性阻斷上皮細胞TGE-β信號，將可能抑制PQ介導(dǎo)的肺間質(zhì)細胞增生。

圖4 SiRNA或TGF-β中和抗體阻斷HPAEpiC細胞分泌TGF-β，將抑制肺間質(zhì)細胞HEL299的增殖Eig.4 Knocking-down/blocking TGE-βby SiRNA or antibody led to the inhibition of HEL299 cells

3 討 論

百草枯（paraquat，PQ）中毒是急診科常見的疾病之一，其發(fā)病率不高，但死亡率近100%。其主要的發(fā)病機制是誘導(dǎo)肺纖維化，進而呼吸衰竭死亡，目前缺乏有效措施［1］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，PQ可以誘導(dǎo)肺上皮細胞發(fā)生“EMT”樣改變，主要通過上皮細胞自分泌TGE-β信號調(diào)控［3］。本研究從肺臟細胞微環(huán)境角度著手，進一步證實PQ誘導(dǎo)的肺間質(zhì)細胞纖維化依賴于上皮細胞的TGE-β信號通路，應(yīng)用特異性siRNA和抗體阻斷肺上皮細胞的TGE-β信號通路將明顯抑制間質(zhì)細胞增殖，提示上皮細胞TGE-β信號可能是PQ中毒的潛在治療靶點。

肺臟是PQ中毒的重要靶器官之一，主要表現(xiàn)為肺水腫、缺氧和呼吸衰竭，最終發(fā)生肺纖維化，引起長期限制性的肺功能障礙而死亡。其主要病理改變?yōu)榉闻K間質(zhì)細胞增生，大量炎癥細胞浸潤，最終不可逆地影響肺通氣功能［2］。

TGE-β是肺上皮細胞分泌的重要細胞因子，其通過與受體結(jié)合激活下游的信號通路，促進細胞增殖和遷移等［4-6］。TGE-β下游信號分子的傳遞需要兩種單跨膜絲氨酸/蘇氨酸受體（Ⅰ、Ⅱ型受體）及Smads蛋白的參與［7］。已經(jīng)報道，激活TGE-β信號，可以引起肝臟和腎間質(zhì)細胞增殖，促進纖維化發(fā)生，阻斷細胞TGE-β信號，將延緩肝和腎硬化的發(fā)生，其分子機制為調(diào)節(jié)前膠原和結(jié)締組織生長因子的表達，促進成纖維細胞的增殖和表型轉(zhuǎn)化，促進細胞外基質(zhì)的分泌和沉著［8-9］，提示TGE-β在間質(zhì)細胞增生中發(fā)揮著重要作用。此外，大量研究報道，激活上皮細胞的TGE-β將促進上皮細胞增殖，促進上皮間質(zhì)化改變，說明TGE-β在上皮和間質(zhì)的增殖中發(fā)揮著不可或缺的作用。

我們首先從肺臟微環(huán)境著手，建立能模擬體內(nèi)環(huán)境的上皮間質(zhì)共培養(yǎng)體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺上皮細胞在PQ處理后可以明顯增加TGE-β表達，但大劑量PQ可以減少TGE-β分泌可能與上皮細胞死亡有關(guān)。上皮細胞分泌的TGE-β是促進間質(zhì)細胞的重要源動力，阻斷上皮細胞TGE-β將可能從源頭上阻止間質(zhì)細胞的增生的啟動，具有重要的臨床意義。我們部分研究結(jié)果與LANG等［10］研究結(jié)果類似，其研究顯示PQ作用于人肺成纖維細胞MRC-5后，TGE-β1水平顯著升高。

本實驗通過建立體外上皮和間質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系，提出了PQ可誘導(dǎo)肺間質(zhì)細胞增生依賴上皮TGE-β信號，阻斷TGE-β信號將抑制間質(zhì)細胞介導(dǎo)的肺纖維化。本研究對PQ致肺纖維化的治療提供了新的思路。

［1］GAWARAMMANA IB，BUCKLEY NA.Medical management of paraquat ingestion［J］.Br J Clin Pharmacol，2011，72：745-757.

［2］GONG P，LU Z，XING J，et al.Traditional Chinese medicine xuebijing treatment is associated with decreased mortality risk of patients with moderate paraquat poisoning［J］.PLoS One，2015，10（4）：e0123504.

［3］高燁，趙娜，李曉青，等.百草枯誘導(dǎo)肺上皮細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進肺纖維化［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2014，13（18）：1491-1493.

［4］孫文鑄，畢黎琦.大鼠肺纖維化形成過程中IGF-I和TGF-β1的表達［J］.吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2007，33（2）：231-234.

［5］楊俊玲，吳艷峰，董春玲，等.肺纖維化小鼠肺泡灌洗液及肺組織中IL-10和TGF-β1的動態(tài)表達［J］.吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2005，31（4）：536-538.

［6］彭海兵，曹福源，王建行，等.槲皮素對硅肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1、磷酸化P38 MAPK表達及血清TNF-α水平的影響［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2014，49（5）：711-715.

［7］MATSUZAKI K.Smad phospho-isoforms direct context-dependent TGF-βsignaling［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2013，24（4）：385-399.

［8］SHEPPARD D.Epithelial-mesenchymal interactions in fibrosis and repair.Transforming growth factor-βactivation by epithelial cells and fibroblasts［J］.Ann Am Thorac Soc，2015，Suppl 1：S21-3.

［9］MENG XM，TANG PM，LI J，et al.TGF-β/Smad signaling in renal fibrosis［J］.Front Physiol，2015，6：82.doi：10.3389/ fphys.2015.00082.

［10］LANG YD，CHANG SF，WANG LF，et al.Chymase mediates paraquat-induced collagen production in human lung fibroblasts［J］.Toxicology Letters，2009，193：19-25.

（編輯 卓選鵬）

Paraquat-induced proliferation of pulmonary stroma fibroblast cells
depends on epithelial cell TGF-βsignaling

GAO Ye，LI Xiao-qing，WU Meng-ru，LIANG Huan
（Department of Emergency，the Eirst Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710061，China）

Objective To investigate the paraquat（PQ）-induced proliferation of stroma fibroblast cells and dissect the mechanisms of epithelial cells'role in the lung microenvironments.Methods HEL299 cell IC50 was determined by MTT assay.TGF-βwas assayed by ELASA.The TGF-βm RNA and protein expressions were also assayed by real-time PCR and Western blot in HPAEpiC-HEL299 cells co-cultured system following paraquat treatment.Results PQ IC50 cutoff in HEL299 cells was 210.3μmol/L.Compared with DMSO control group，PQ could induce the proliferation of lung stroma fibroblast HEL299 cells，which was dependent on the signaling of epithelial HPAEpiC cell TGF-β.However，inhibition of TGF-βsignaling by si RNA or specific antibody abolished PQ-mediated HEL299 cell proliferation.Conclusion PQ's promoting the proliferation of human lung stroma cells depends on the signaling of epithelial cell TGF-β.Our conclusion provides a new mechanism for PQ-induced pulmonary fibrosis and blocking epithelia TGF-βsignaling will be a potential therapeutic target for PQ toxicity.

paraquat；pulmonary fibrosis；transforming growth factor-β（TGF-β）

R595

A

10.7652/jdyxb201505009

2015-02-28

2015-05-28

陜西省自然科學(xué)基金資助項目（No.2013JM4069）Supported by the Natural Science Eoundation of Shaanxi Province（No.2013JM4069）

高燁.E-mail：xiaogaoego@163.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150717.1723.014.html（2015-07-17）