賈曉燕,熊 源,黃凌風(fēng),林施泉,陸家昌,吳林南,李 玲

(1.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院,2.廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院,福建廈門361102)

一種海洋領(lǐng)鞭毛蟲的分離與鑒定

賈曉燕1,熊 源1,黃凌風(fēng)2*,林施泉1,陸家昌1,吳林南1,李 玲1

(1.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院,2.廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院,福建廈門361102)

采用微液滴操作法在廈門海域分離培養(yǎng)了一株海洋鞭毛蟲C6,運(yùn)用顯微鏡觀察和18S r DNA基因技術(shù)鑒定其種類,并將其與GenBank中已知的14種海洋鞭毛蟲18S rDNA序列比較,用NJ法和UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.通過PCR擴(kuò)增獲得1 774 bp 18S r DNA序列,與NCBI已登陸的其他同源序列進(jìn)行系統(tǒng)分析,結(jié)果顯示此海洋鞭毛蟲屬于領(lǐng)鞭毛蟲(choanoflagellates).與已知種Monosiga brevicollis的相似性為99%,為進(jìn)一步研究該種鞭毛蟲提供了遺傳背景,但要明確其種類還需其他研究佐證.

海洋鞭毛蟲;分離;18S r DNA;分子鑒定

異養(yǎng)鞭毛蟲(heterotrophic flagellate)在海洋中分布廣泛,從河口區(qū)到大洋區(qū),從熱帶到極地海域,都能發(fā)現(xiàn)其存在[1].異養(yǎng)鞭毛蟲是重要的細(xì)菌捕食者,能通過攝食作用影響細(xì)菌的群落組成,是海洋微食物環(huán)的重要組成部分,在海洋生態(tài)系統(tǒng)物流、能流中發(fā)揮著重要作用[2].在鞭毛蟲分布調(diào)查中,領(lǐng)鞭毛蟲(choanoflagellates)是常見的海洋異養(yǎng)鞭毛蟲[3],領(lǐng)鞭毛蟲的領(lǐng)由一圈偽足組成,捕食的時(shí)候利用一根鞭毛激起水流,通過領(lǐng)來過濾懸浮顆粒物——主要是細(xì)菌.這個(gè)類群的種類很多,它們之間的形態(tài)略為不同,依靠細(xì)胞覆蓋物的形狀和組成來區(qū)分.作為與后生動(dòng)物最接近的單細(xì)胞生物,領(lǐng)鞭毛蟲具有重要的進(jìn)化地位,但對(duì)領(lǐng)鞭毛蟲的分子發(fā)育系統(tǒng)研究仍然有限[4].由于海上調(diào)查條件有限,不易對(duì)其進(jìn)行分離培養(yǎng),且鞭毛蟲個(gè)體微小,普通光學(xué)顯微鏡下難以通過形態(tài)觀察進(jìn)行準(zhǔn)確分類.

本研究采用微液滴操作法在廈門附近海域分離并純化一種海洋鞭毛蟲,借助顯微鏡初步判斷為領(lǐng)鞭毛蟲,進(jìn)一步利用18S r DNA序列的擴(kuò)增和測序分析,并與Genbank中已知種類進(jìn)行比對(duì),確定其種類.目前關(guān)于海洋鞭毛蟲的研究,大部分是以一個(gè)“黑箱”來處理,因此,我們對(duì)該鞭毛蟲的分離與鑒定不僅有助于揭示異養(yǎng)鞭毛蟲的種類組成及遺傳背景研究,對(duì)進(jìn)一步研究異養(yǎng)鞭毛蟲的生態(tài)作用有積極意義.

1 材料與方法

1.1 材 料

本實(shí)驗(yàn)所用海洋鞭毛蟲是由廈門大學(xué)海洋生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室在廈門大學(xué)附近海域分離培養(yǎng)得到的單種株(C6).Taq酶等PCR所需試劑購自TakaRa公司;凝膠回收試劑盒(Agarose Gel DNA Purification Kit)與其他生化試劑均購自上海生工生物股份有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 鞭毛蟲的分離純化

微液滴操作法[5]:用自制毛細(xì)管從天然海水中吸取微量液體在顯微鏡下確認(rèn)液滴中鞭毛蟲的數(shù)量,如只有一個(gè)鞭毛蟲,利用吸管的毛細(xì)作用重新吸回液滴,并轉(zhuǎn)移到預(yù)先備好的培養(yǎng)液中.將挑好的個(gè)體放在20～25℃下培養(yǎng),培養(yǎng)液為添加酵母提取物(終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%)的過濾海水,并接種從海水中分離的細(xì)菌作為異養(yǎng)鞭毛蟲的食物.培養(yǎng)約3～4 d后取樣在400和1 000倍顯微鏡視野下觀察,確認(rèn)是否成功分離出純種.異養(yǎng)鞭毛蟲的細(xì)胞外觀、鞭毛數(shù)量和形態(tài)、游泳行為作為是否為純培養(yǎng)的判斷依據(jù).通常分離2～3次后能達(dá)到純化的效果.

1.2.2 顯微鏡樣品處理

取1 m L處于指數(shù)生長期的鞭毛蟲培養(yǎng)液,加入10μL Lugol′s試劑固定,在Leica FW4000熒光顯微鏡下觀察其形態(tài)特征.

取10 m L經(jīng)戊二醛固定的樣品,加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,最終質(zhì)量濃度為5μg/m L)染色10 min后,低壓(＜20 kPa)過濾到0.22μm的Millipore黑膜上,在紫外和藍(lán)色激發(fā)光下利用顯微鏡觀察其形態(tài)特征.

1.2.3 總DNA的提取和PCR擴(kuò)增

取單種培養(yǎng)的鞭毛蟲培養(yǎng)液2 m L,離心棄上清.用酚-三氯甲烷方法[6]提取總DNA.

PCR擴(kuò)增引物見表1.擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min.PCR擴(kuò)增結(jié)果用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測.

表1 PCR擴(kuò)增引物[7]Tab.1 Primers used in this study[7]

1.2.4 PCR產(chǎn)物的克隆和測序

將PCR產(chǎn)物用上海生工凝膠回收試劑盒回收后,將目標(biāo)片段連接到質(zhì)粒載體PMD18-T上,轉(zhuǎn)入細(xì)菌DH5α.測序由南京金斯瑞公司完成.

1.2.5 序列分析

在NCBI服務(wù)器上用Nucleotide Blast進(jìn)行同源檢測,將測得的序列和其他相關(guān)鞭毛蟲序列,用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行計(jì)算分析.應(yīng)用Clustal X 1.83進(jìn)行多序列對(duì)位分析,應(yīng)用MEGA 3.1軟件NJ法和UPGMA法建立系統(tǒng)樹,用Maximum Composite Likelihood計(jì)算遺傳距離值,重復(fù)1 000次計(jì)算bootstrap值,節(jié)點(diǎn)數(shù)值表示1 000次重復(fù)抽樣所獲得的自檢支持百分率.

2 結(jié) 果

2.1 鞭毛蟲的形態(tài)學(xué)特征

在光學(xué)顯微鏡下(1 000×)該類鞭毛蟲細(xì)胞體呈梨形(見圖1(a)),細(xì)胞長軸3～5μm,一根長鞭毛,長度是體長的1～2倍.該鞭毛蟲多營自由生活,常單細(xì)胞生活,不與相同種類的其他個(gè)體形成群體(見圖1 (a)和(b)).在光學(xué)顯微鏡下,不易觀察其領(lǐng)狀結(jié)構(gòu).該類鞭毛蟲無色素,在熒光顯微鏡下觀察,藍(lán)色激發(fā)光下未見有紅色發(fā)光(葉綠素特征,見圖1(c)),因此可以斷定該類群鞭毛蟲是異養(yǎng)鞭毛蟲.該鞭毛蟲運(yùn)動(dòng)方式以直線運(yùn)動(dòng)為主,可通過螺旋式旋轉(zhuǎn)來改變運(yùn)動(dòng)方向,在水體中主要營浮游生活.

圖1 在顯微鏡下觀察此鞭毛蟲Fig.1 The observation of this flagellate under the optical microscope

2.2 18S r DNA序列的擴(kuò)增和序列分析結(jié)果

對(duì)C6基因組DNA(見圖2(a))使用真核生物18S r DNA通用引物,PCR擴(kuò)增得到的目的片段(見圖2 (b)),經(jīng)過1%瓊脂糖電泳分析,DNA片段為1 700 bp左右.由測序結(jié)果得知目的片段為1 774 bp, G和C所占比例為45.77%.將該18S r DNA序列(Genbank登陸號(hào)為KM387288)進(jìn)行BLAST搜索,序列覆蓋度在90%以上的同源性序列100條,最大序列相似度(maximum identification)在90%以上的有38條,其中與Monosiga brevicollis的18S r DNA相似度最高,達(dá)到99%.

圖2 DNA提取電泳結(jié)果(a)和PCR電泳結(jié)果(b)Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of total DNA(b)and 18S rDNA(b)

用MEGA3.1軟件按照NJ法(圖3)和UPGMA兩種方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.用兩種方法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹樹形幾近相同,而且在每個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹中C6與Monosiga brevicollis的節(jié)支點(diǎn)的支持率都很高,分別為99(NJ法)和100(UPGMA法).從本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可知,這15種鞭毛蟲主要分成兩簇.一簇主要由領(lǐng)鞭毛蟲(Monosiga brevicollis和Monosiga ovata Hoglet),雙并鞭類(Uncultured bicosoecid,Siluania monomastiga和Neobodo designiss)以及分類地位不明確的Pleurostomum flabellatum組成;一簇主要由波豆類(Bodo caudatus和Rhynchomonas nasuta)和分類地位不明確的種類(Dysnectes brevis和Dimastigella trypaniformis)組成以及一種Placididea,一種雙并鞭類和一種隱藻類.為進(jìn)一步分析此種與其他鞭毛蟲的親緣關(guān)系,將所有序列用MEGA3.1計(jì)算它們之間的遺傳距離值.C6與已知的14中鞭毛蟲的遺傳距離為0.296～6.536,其中與Monosiga brevicollis的遺傳距離最小,為0.296.

3 討 論

將C6的序列與基因庫中已知的14種海洋鞭毛蟲序列進(jìn)行比較可知與本種最接近的是Monosiga brevicollis,用Kimura 2-parameter計(jì)算C6與Monosiga brevicollis遺傳距離值,重復(fù)1 000次計(jì)算bootstrap值為0.282,小于0.3,小于種間遺傳距離的范圍,二者應(yīng)為同一種.從形態(tài)學(xué)上觀察,此鞭毛蟲為單細(xì)胞生長,細(xì)胞大小為3～5μm,這與Atkins的研究結(jié)果[8]一致.Atkins報(bào)道[8]Monosiga brevicollis大小為3～7μm,但是該報(bào)道中長鞭毛的長度為5倍體長,而此種為1～2倍體長.長鞭毛長度差異的存在可能是在Lugol′s或戊二醛試劑固定時(shí),長鞭毛脫落或損傷造成的.通過以上形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分析推測,C6應(yīng)為領(lǐng)鞭毛蟲的Monosiga brevicollis.在光學(xué)顯微鏡下觀察不易發(fā)現(xiàn)領(lǐng)狀結(jié)構(gòu),有待于電鏡結(jié)果佐證.

領(lǐng)鞭毛蟲是世界性廣布種,從海洋到淡水,從極地海域到熱帶海域都有其種類報(bào)道[9-12].有研究表明領(lǐng)鞭毛蟲主要以細(xì)菌為食,同時(shí)也是海洋微型浮游生物和有機(jī)碎屑的初級(jí)消費(fèi)者,因此領(lǐng)鞭毛蟲的豐度與同群落中的其他微微型浮游生物關(guān)系密切,且領(lǐng)鞭毛蟲的密度與初級(jí)生產(chǎn)力成正相關(guān),這就決定了領(lǐng)鞭毛蟲在微食物環(huán)和碳循環(huán)過程中的重要作用[9].但是領(lǐng)鞭毛蟲的系統(tǒng)分類地位一直是個(gè)爭論的問題.Levine等[13]1980年確定它隸屬于原生動(dòng)物亞界,肌鞭毛門,動(dòng)鞭毛綱,領(lǐng)鞭毛目.1991年P(guān)atterson等[3]從鞭毛蟲的形態(tài)和功能作用對(duì)異養(yǎng)鞭毛蟲重新定義,領(lǐng)鞭毛蟲即為其中一類.產(chǎn)生這種分類結(jié)果的原因可能是由于之前有關(guān)海洋鞭毛蟲的研究較少,在基因庫中能搜索到的,可用比較的序列有限.不過從已有結(jié)果可知,領(lǐng)鞭毛蟲與雙并鞭類的親緣關(guān)系較近.Monosiga brevicollis是多細(xì)胞動(dòng)物現(xiàn)存最近的單細(xì)胞親緣種,同時(shí)它也被看做是連接真菌與多細(xì)胞生物之間的重要紐帶.King等[14]2008年發(fā)表了Monosiga brevicollis的基因組系列研究表明,該基因組具有富含內(nèi)含子(intron)的基因,它們是一些編碼蛋莊區(qū)域,其特征是與細(xì)胞黏附及動(dòng)物的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān).因此對(duì)海洋領(lǐng)鞭毛蟲尤其是Monosiga brevicollis的深入研究有助于了解多細(xì)胞生物的起源.本研究從海水中分離純化得到一種鞭毛蟲,從形態(tài)學(xué)和核酸序列進(jìn)行分析,顯示此種應(yīng)為Monosiga brevicollis,從而為研究其生理生態(tài)特征,及進(jìn)一步進(jìn)行開發(fā)利用等提供了遺傳背景.

圖3 單種C6及其相關(guān)屬種18S r DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of C6 and other relative species based on 18S r DNA

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Morphological and Molecular Identification of a Marine Flagellate

JIA Xiao-yan1,XIONG Yuan1,HUANG Ling-feng2*, LIN Shi-quan1,LU Jia-chang1,WU Lin-nan1,LI Ling1
(1.College of Ocean&Earth Sciences,Xiamen University, 2.College of the Environment&Ecology,Xiamen University,Xiamen 361102,China)

:Using microscope and 18S r DNA techniques,a strain of nanoflagellate(C6)separated in Xiamen Bay was identified and analyzed.One 1 774 bp fragment of 18S rDNA was amplified from the strain C6.Homology analysis between the yielded sequence and the 18S r DNA sequences accessed in the National Center for Biotechnology Information(NCBI)from other strains showed that C6 belonged to choanoflagellates,which shared 99%homologue with the known species of Monosiga brevicollis.Choanoflagellates play a very important role in biological evolution and marine ecology,however,molecular phylogenetic studies within choanoflagellates are still extremely limited.According to results of morphological and DNA sequence analysis,we consider that C6 should be Monosiga brevicollis,but more collaborations are still required for specific identification.This study provides basic genetic information for further study of physiological characteristics and ecological functions of the strain C6 in Xiamen Bay.

marine flagellate;isolation;18S r DNA;molecular identification

Q 945.11

A

0438-0479(2015)03-0436-04

10.6043/j.issn.0438-0479.2015.03.025

2014-05-06 錄用日期:2015-01-13

國家自然科學(xué)基金(41376131);國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2011CB409804)

*通信作者:huanglf@xmu.edu.cn

賈曉燕,熊源,黃凌風(fēng),等.一種海洋領(lǐng)鞭毛蟲的分離與鑒定[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2015,54(3):436-439.

:Jia Xiaoyan,Xiong Yuan,Huang Lingfeng,et al.Morphological and molecular identification of a marine flagellate[J]. Journal of Xiamen University:Natural Science,2015,54(3):436-439.(in Chinese)