魏 靜，楊希祥，石寧寧，宋小鳳，馮 沖，潘登科*，臧榮鑫

(1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；3.南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江蘇南京210095)

胰腺特異性表達Hes1基因的構(gòu)建及體外表達

魏 靜1,2，楊希祥2,3，石寧寧2，宋小鳳2，馮 沖2，潘登科1,2*，臧榮鑫1*

(1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；3.南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江蘇南京210095)

為了探究胰腺的發(fā)育機制，以及制備胰腺缺陷型的小型豬模型，構(gòu)建了特異性表達載體，開展了相關(guān)載體構(gòu)建及體外驗證研究.本研究以小鼠PDX1啟動子為特異性啟動元件，構(gòu)建胰腺特異性啟動小鼠Hes1基因的表達載體PDX1-Hes1，載體轉(zhuǎn)染MIN-6胰島β細胞、豬耳成纖維細胞及豬腎細胞，培養(yǎng)48 h 后，通過qRT-PCR、Western Blot檢測.結(jié)果顯示：Hes1在MIN-6胰島β細胞中的RNA水平和蛋白水平均高效表達，而在非胰腺細胞豬耳成纖維細胞及豬腎細胞中均不表達.試驗表明：胰島特異性表達載體PDX1-Hes1的成功獲得，為構(gòu)建相關(guān)基因在胰腺中特異性表達的載體提供參考，為后續(xù)制備胰腺缺陷型的小型豬提供了條件.

胰腺特異性表達；MIN-6胰島β細胞；體外驗證

近年來，糖尿病在我國發(fā)生的人數(shù)不斷增多，患者數(shù)量居全球第一[1]，且具有年輕化的趨勢，糖尿病成為嚴重危害人類健康的重要疾病之一.隨著人們經(jīng)濟能力的提高和醫(yī)院移植技術(shù)的不斷完善，糖尿病患者對胰腺移植的需求與日俱增，胰腺移植供體卻嚴重缺乏.器官移植是治療人類器官衰竭，挽救人類生命的有效方法.由于器官移植供體來源缺乏，異種移植研究成為熱門.在豬體內(nèi)長出人源化器官成為器官異種移植供體來源之一，利用豬生產(chǎn)人源化胰腺，為解決糖尿病患者胰腺移植供體不足的問題提供了新思路.

PDX1(Pancreatic and duodenal home box factor-1)即胰腺十二指腸同源框蛋白1，它在胰腺生長發(fā)育過程中扮演重要角色.PDX1作為轉(zhuǎn)錄因子在胰腺中特異性表達，可以促進胰腺的早期發(fā)育和晚期胰島細胞的分化，同時，PDX1在維持成體β細胞功能方面也起著重要的作用[2～3].這說明PDX1啟動子具有特異性啟動功能.Hes1(Hairy and enhancer of split homolog 1)是Notch信號通路系統(tǒng)的重要效應分子[4]，其基因編碼的蛋白主要負責轉(zhuǎn)錄抑制，通過轉(zhuǎn)錄抑制影響胚胎發(fā)育期的細胞增殖和分化，并通過負反饋調(diào)控自我表達水平[5～6].最近研究發(fā)現(xiàn)，Hes1基因和胰腺發(fā)育有著密切的關(guān)系，在豬的胰腺形成時期，由PDX1啟動子啟動Hes1基因特異性過表達會生成胰腺缺陷豬[7].目前國內(nèi)尚無類似報道.本試驗成功構(gòu)建了胰腺特異性表達載體PDX1-Hes1，建立了一條研究胰腺發(fā)育的特異性表達系統(tǒng)，為后續(xù)構(gòu)建相關(guān)載體制備胰腺缺陷豬和研究胰腺發(fā)育提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠胰島素瘤β細胞株MIN-6細胞由解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌實驗室母義明教授惠贈；豬耳成纖維細胞由本實驗室保存；PDX1-cre載體購自addgene；pEASY-T1 Simple Cloning Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Premix TaqTM(LA TaqTMVersion 2.0 plus dye)酶購自寶生物工程(大連)有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒購自凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司；限制性內(nèi)切酶主要購自New England Biolabs公司；抗體購自Santa Cruz公司和康為世紀生物技術(shù)有限公司；細胞培養(yǎng)相關(guān)耗材購自Corning公司和ScienCell公司；Sybr Select Master Mix購自Applied Biosystems公司；Western Blot實驗材料購自碧云天生物技術(shù)公司和康為世紀生物科技有限公司；RNA及DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；其他化學試劑均購自Sigma-Aldrich公司.細胞轉(zhuǎn)染依照NucleofectorⅡ轉(zhuǎn)染儀及轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染.

1.2 引物設計

參考GenBank中小鼠Hes1基因序列(登錄號：NC_000082)，設計引物為Hes1 F/R，片段大小為878 bp.參考GenBank中兔β-globin基因序列(登錄號：NC_013669.1)，設計引物RB F/R從兔DNA中擴增出兔β-globin 3′調(diào)控元件(rabbit β-globin 3′flanking sequence，RB)，片段大小為1 125 bp；GAPDH為管家基因，引物為mGAPDH F/R產(chǎn)物長191 bp；表達檢測引物qF1/R1，片段大小為176 bp；實時定量檢測引物qF2/R2，片段大小為156 bp；設計引物的同時要加上相關(guān)酶切位點序列(詳見表1及圖1).PCR擴增反應體系(20 μL)：H2O 7 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板(50 ng/μL)2 μL，Premix TaqTM(LA TaqTMVersion 2.0 plus dye)10 μL.

表1 引物名稱、序列、產(chǎn)物長度

1.3 PDX1-Hes1載體的構(gòu)建

通過PCR技術(shù)從兔血DNA中擴增出RB，TA克隆后測序，獲得T-RB克隆載體.將Hes1通過EcoRⅠ酶切位點插入到T-RB克隆載體中，克隆后經(jīng)PCR鑒定為陽性的菌液送中美泰和公司測序，獲得T-RB-Hes1重組質(zhì)粒.PDX1-cre骨架載體和T-RB-Hes1重組質(zhì)粒分別用XbaⅠ、NotⅠ兩個酶進行雙酶切，將PDX1啟動子的骨架載體片段和RB-Hes1基因片段連接構(gòu)成PDX1-RB-Hes1重組質(zhì)粒，克隆后經(jīng)PCR鑒定為陽性的菌液送中美泰和公司測序，最終成功構(gòu)建了PDX1-Hes1載體(圖1)，并經(jīng)酶切驗證正確后進行后續(xù)試驗.

1.4 細胞培養(yǎng)、載體的轉(zhuǎn)染

五指山小型豬耳成纖維細胞和豬腎細胞用高糖DMEM培養(yǎng)基(含15%胎牛血清，3.7 g/L碳酸氫鈉、66mg/L青霉素、100mg/L鏈霉素、3.57 g/L HEPES)，在37 ℃，5%CO2中培養(yǎng)至細胞≥80%融合時消化，進行傳代、凍存或?qū)嶒?

小鼠胰島素瘤β細胞株MIN-6細胞在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱，高糖DMEM培養(yǎng)基中(需添加64 μmol/Lβ-巰基乙醇)培養(yǎng)至細胞≥80%融合時消化，進行傳代、凍存或?qū)嶒瀃8].

1.5 qRT-PCR和Western Blot

PDX1-Hes1載體使用無內(nèi)毒素大提試劑盒提取后，轉(zhuǎn)染準備.轉(zhuǎn)染前24 h，以3×105細胞接種6孔板.轉(zhuǎn)染步驟依照NucleofectorⅡ轉(zhuǎn)染儀及轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，每孔DNA用量為4 μg，以不轉(zhuǎn)染載體的MIN-6胰島β細胞組為陰性對照，培養(yǎng)48小時后收集細胞，分別提取細胞總RNA和細胞總蛋白.

圖1 表達載體結(jié)構(gòu)示意圖和對應的酶切位點

qRT-PCR：轉(zhuǎn)染48 h后的MIN-6胰島β細胞、豬耳成纖維細胞和豬腎細胞，收集細胞提取RNA，定量1.5 μg反轉(zhuǎn)為cDNA.根據(jù)Hes1 cDNA設計高度特異性引物qHes1 F2/R2檢測轉(zhuǎn)染后細胞中Hes1的mRNA 的表達.選取GAPDH為內(nèi)參基因，取1.5 μL模板進行qRT-PCR檢測.使用ABI 7500型定量PCR儀進行定量分析，每個待測樣本設3個重復.采用相對定量方法進行定量分析.

Western Blot：用預冷的PBS洗脫轉(zhuǎn)染48 h后的MIN-6胰島β細胞、豬耳成纖維細胞和豬腎細胞，離心收集，使用RIPA裂解液分別提取兩種細胞的總蛋白，95 ℃變性10 min.Bradford法定量，各取50 μg蛋白上樣，5% SDS-PAGE上層膠和10% SDS-PAGE下層膠80 V電泳3 h，120 V轉(zhuǎn)膜2 h，用PBST稍加漂洗，浸沒于5%脫脂奶粉封閉液中緩慢搖蕩2 h，PBST洗膜3次，每次10 min，HES1 Antibody (E-5)一抗(Santa Cruz；SC-166410)4 ℃過夜孵育，PBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光儀成像.

圖2 PDX1-Hes1酶切驗證 圖3 RT-PCR表達檢測

注：1：EcoRⅠ酶切；2:XbaI和NotI雙酶切； 注：A．耳成纖維細胞；B．腎細胞；C．MIN-6胰島β細胞；1．qF1/R1；

M：DNA Maker(5 000 bp) 2．GAPDH-F/R；—：空白對照；M：DNA Maker 2000

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建及酶切驗證

載體PDX1-Hes1構(gòu)建步驟見圖1所示，用EcoRⅠ進行酶切得到Hes1片段，大小為866 bp.再用XbaⅠ、NotⅠ進行酶切得到RB-Hes1片段，大小為1 976 bp，酶切電泳結(jié)果見圖2所示.結(jié)果表明，PDX1-Hes1載體構(gòu)建成功.

圖4 qRT-PCR表達檢測 圖5 Western blot分析Hes1的表達

注：—為陰性細胞; +為陽性細胞

2.2 RT-PCR與qRT-PCR

轉(zhuǎn)染MIN-6胰島β細胞、耳成纖維細胞和腎細胞的RT-PCR(引物：qF1/R1)檢測結(jié)果顯示，僅在MIN-6胰島β細胞有表達，耳成纖維細胞和腎細胞均無表達(圖3).說明本實驗構(gòu)建的載體能特異性地表達于胰島β細胞.

qRT-PCR(引物：qF2/R2)檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)PDX1-Hes1載體的陽性MIN-6胰島β細胞RNA水平表達極顯著高于未轉(zhuǎn)染載體的陰性MIN-6胰島β細胞(P<0.001)，內(nèi)參基因為GAPDH，說明本實驗構(gòu)建的載體能高效表達于胰島β細胞.

2.3 Western Blot

Western blot檢測顯示轉(zhuǎn)PDX1-Hes1載體的MIN-6胰島β細胞和陰性MIN-6胰島β細胞在35 kDa處均有特異性條帶，且與預期蛋白大小一致，證明兩種載體在胰島β細胞中均有表達.結(jié)果顯示：在陽性MIN-6胰島β細胞中表達量顯著高于陰性細胞，證明本實驗構(gòu)建的載體在蛋白水平能高效表達胰島β細胞.

3 討論

目前，糖尿病已成為威脅全人類健康的重要疾病之一，是目前世界上最普遍和最具挑戰(zhàn)性的重大公共衛(wèi)生問題之一[9].異種胰島移植的研究為根治糖尿病帶來希望，但直接將豬的胰腺移植給糖尿病人會出現(xiàn)嚴重排斥反應，且異種胰腺會迅速壞死.為了解決超急性免疫排斥，國際上Lai等[10]采用敲除α-1 ,3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因的胎兒成纖維細胞作核供體，獲得了α-1 ,3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因敲除豬.2011年，潘登科課題組在我國率先獲得了敲除α-1 ,3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因的異種器官移植豬[11]，目前通過敲除α-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因基本解決了異種移植時的超急性免疫排斥反應.在敲除Gal基因豬的基礎上通過胚胎嵌合制備人源化胰腺成為克服異種移植免疫排斥的一種新思路.本試驗成功地構(gòu)建了胰腺高效表達Hes1基因的載體，因為Hes1基因和胰腺發(fā)育有著密切的關(guān)系，在豬的胰腺形成時期，通過表達Hes1基因會抑制胰腺的發(fā)育，從而制備胰腺缺陷豬[7].為了提高載體翻譯效率，本實驗前期制備了eGFP報告基因的模擬載體，通過優(yōu)化比較證明在載體中添加kozak序列能夠有效提高翻譯效率[12].最終本研究選取了帶有kozak序列的PDX1-Hes1載體，并進行了體外細胞驗證，結(jié)果表明了載體在小鼠胰島β細胞中特異性高效表達.

PDX1是胰腺發(fā)育、分化及維持體內(nèi)葡萄糖代謝穩(wěn)定的一種轉(zhuǎn)錄因子[13]，也是β細胞形成和成熟的標志之一[14].PDX1特異性表達于胰腺和十二指腸中，在PDX1基因敲除的小鼠中，未發(fā)現(xiàn)成熟的胰腺組織，十二指腸的一些區(qū)域也出現(xiàn)異常，在出生后很快死于高血糖癥[15]，在缺乏功能性的PDX1蛋白的人群中，導致胰腺發(fā)育不全，但未造成缺失[16].由此可見，僅通過敲除PDX1基因獲得的胰腺缺失動物存在問題，用之生產(chǎn)嵌合人源化胰腺的思路并不可行.有研究表明,在胚胎發(fā)育時期強迫Notch通路激活，誘使Hes1表達上升阻斷胰腺內(nèi)分泌細胞核外分泌細胞發(fā)育，并使胰腺外分泌細胞去分化，形成胰腺缺陷[17～18].通過PDX1啟動子啟動Hes1基因特異性表達，因此過表達Hes1來制備胰腺缺陷豬可以規(guī)避相關(guān)問題，且胰腺缺失后PDX1基因的存在對人源化胰腺的形成發(fā)育及胰腺功能維持有重要作用，有利于胰腺嵌合豬的正常生長.

本研究成功構(gòu)建了PDX1-Hes1載體，為后續(xù)胰腺缺陷豬的制備打下基礎，而Notch通路與胰腺發(fā)育有著密切關(guān)系.在本研究構(gòu)建載體PDX1-Hes1的基礎上構(gòu)建相關(guān)載體，以胰腺缺陷動物模型為研究對象，來研究Notch通路.同時，也可以結(jié)合Notch信號通路構(gòu)建相關(guān)基因表達載體來研究基因功能及胰腺發(fā)育機理.

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Construction and in Vitro Expression of Vectors Which Specifically Express Hes1 in Pancreas

WEI Jing1, 2,YANG Xi-xiang2, 3,SHI Ning-ning2,SONG Xiao-feng2,FENG Chong2,PAN Deng-ke1, 2，ZANG Rong-xin1

(1. Life Science and Engineering College of Northwest University for Nationalities，Lanzhou， 730030，China；2. Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；3. College of Animal Science and Technology，Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095，China)

The present study aimed to explore the development mechanism of pancreas, as well as the preparation of the pancreas miniature pig model of defect type, build the specific expression vector, conduct the related carrier construction and validation studies in vitro. PDX1 promoter of mice was token as a specific promoter element，the expression vector PDX1-Hes1 was constructed of pancreas-specific promoter Hes1 gene. This expression vector was transfected into MIN-6 pancreatic β cells, fibroblasts of pig ears and swine kidney cells. They were cultured for 48h and detected with qRT-PCR and Western Blot assay. The results showed that Hes1 RNA and protein levels were highly expressed in MIN-6 pancreatic β cells, but not fully expressed in fibroblasts of pig ears and swine kidney cells. The test demonstrated the PDX1-Hes1 of the islet specific expression vector was successfully obtained, which provided a reference for constructing the vector of carrier-related genes specifically expressing in the pancreas. It also built the conditions for preparing the miniature swine of pancreas deficient in the future.

Specific expression of pancreas；MIN-6 pancreatic β cell；In vitro validation

2015-05-20

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(2015CB554103)；西北民族大學研究生科研創(chuàng)新項目資助(ycx14167).

*

魏靜(1988—)，女，山西太原人，碩士研究生，主要從事基因與細胞工程研究.

Q78

A

1009-2102(2015)02-0016-05