彭建明，蘇蘭娣，羅 雪，葉記林，于有江

（揚(yáng)州職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

眼鏡蛇長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素鎮(zhèn)痛效應(yīng)及可能機(jī)制

彭建明，蘇蘭娣，羅 雪，葉記林，于有江

（揚(yáng)州職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

目的探究眼鏡蛇長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素（CBT）的鎮(zhèn)痛作用及可能機(jī)制。方法采用在體細(xì)胞外記錄方法記錄慢性炎癥痛模型大鼠脊髓背角神經(jīng)元的痛誘發(fā)放電，分別對(duì)六組實(shí)驗(yàn)大鼠注射生理鹽水（5 μL）、CBT（20、40、80 ng/kg）、阿托品（2 mg/kg）、阿托品（2 mg/kg）+CBT（40 ng/kg），觀察不同含量CBT對(duì)脊髓背角神經(jīng)元痛誘發(fā)放電的影響，同時(shí)觀察膽堿能受體拮抗劑阿托品能否翻轉(zhuǎn)其鎮(zhèn)痛效應(yīng)。結(jié)果不同含量CBT均可以顯著抑制慢性炎癥痛大鼠脊髓背角神經(jīng)元的痛誘發(fā)放電，各含量CBT組放電頻率與生理鹽水組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且該效應(yīng)可被阿托品所阻斷，阿托品+CBT組在20、30、40、50、60 min放電頻率與CBT（40 ng/kg）組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論CBT具有顯著的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，該效應(yīng)有一定的劑量依賴性，膽堿能受體系統(tǒng)參與了其鎮(zhèn)痛過(guò)程。

眼鏡蛇毒液類； 眼鏡蛇屬； 神經(jīng)毒素類； 鎮(zhèn)痛

疼痛是一種伴隨組織損傷的復(fù)合感覺(jué)，常與心理活動(dòng)、運(yùn)動(dòng)反射、情緒等交織在一起，往往具有個(gè)體差異、令人不悅的感覺(jué)和情緒上的感受。疼痛的生物學(xué)意義具有雙重特點(diǎn)：一方面是機(jī)體不可或缺的一種特殊保護(hù)功能，出現(xiàn)痛覺(jué)的防御反應(yīng)，進(jìn)而警告機(jī)體及時(shí)采取措施來(lái)避免進(jìn)一步的傷害，減輕病痛；另一方面，其又可形成病理性的慢性疼痛綜合征，許多劇烈的持續(xù)性疼痛對(duì)人體造成嚴(yán)重的折磨，給人類造成的苦難和傷害也是不可估量的。目前雖然有手術(shù)、針刺、藥物等減輕痛覺(jué)感受的方法，但均有其局限性，因此，尋求一種有效的鎮(zhèn)痛方法一直是患者和臨床工作者的述求。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)很早就有利用蛇毒為人類服務(wù)的記載。蛇毒是一種由蛇毒腺分泌的復(fù)雜混合物，按其作用部位與方式主要分為2種基本類型：一種是作用于神經(jīng)-肌肉接頭的接頭前膜，進(jìn)而抑制突觸前神經(jīng)元乙酰膽堿的釋放，故稱為突觸前神經(jīng)毒素，也稱為β-神經(jīng)毒素；另一種是作用于神經(jīng)-肌肉接頭處的接頭后膜，與接頭后膜上的膽堿能受體結(jié)合后抑制乙酰膽堿的作用，進(jìn)而可引起肌肉松弛，稱為突觸后神經(jīng)毒素，也稱為α-神經(jīng)毒素。這2種蛇毒神經(jīng)毒素都阻斷神經(jīng)-肌肉接頭處的興奮傳遞，引起肌肉麻痹、松弛。有研究發(fā)現(xiàn)，眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素除了有抗腫瘤、抗炎、治療心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用外，還具有鎮(zhèn)痛作用[1-4]。有研究結(jié)果顯示，在小鼠的扭體法和熱板法的行為測(cè)試中，分離出來(lái)的眼鏡蛇長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素（cobratoxin，CBT）可產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，并能夠明顯抑制慢性炎癥大鼠的痛反應(yīng)[5-6]。因此，本實(shí)驗(yàn)主要采用在體細(xì)胞外記錄的方法觀察CBT對(duì)慢性炎癥痛模型大鼠脊髓背角神經(jīng)元單位放電的影響，同時(shí)分析其鎮(zhèn)痛效應(yīng)與膽堿能受體的關(guān)系，以探討CBT鎮(zhèn)痛效應(yīng)的可能機(jī)制，為臨床開(kāi)發(fā)蛇毒作為鎮(zhèn)痛藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 無(wú)特定病原體SPF級(jí)雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量220～320 g，由揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。12 h明暗交替光照，給予充足的水源和飼料。根據(jù)實(shí)驗(yàn)中注射試劑不同，將建立模型后選擇出來(lái)的實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為六組：生理鹽水組、不同含量CBT組（20、40、80 ng/kg）、阿托品組、阿托品+CBT組，每組8只。實(shí)驗(yàn)所用阿托品購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 建立慢性炎癥痛模型 在每只健康大鼠的右側(cè)后肢足底皮下注射完全弗氏佐劑（complete Freund′s adjuvant，CFA）0.15 mL，注射后局部炎性反應(yīng)明顯。選取注射CFA 7 d后，皮溫升高，右足紅腫，右側(cè)后肢踝關(guān)節(jié)腫脹，經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)痛覺(jué)過(guò)敏的大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。生理鹽水組：在每只健康大鼠右側(cè)后肢相同部位注射同樣容積的生理鹽水作為對(duì)照，1周后未見(jiàn)紅腫、皮溫升高及痛覺(jué)過(guò)敏等現(xiàn)象。

1.2.2 動(dòng)物準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)用健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～320 g，4%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，氣管插管，固定動(dòng)物于立體定位儀上。大鼠脊柱固定，于腰膨大T13至L1處行椎板切開(kāi)術(shù)，切開(kāi)脊髓的硬脊膜與蛛網(wǎng)膜，使暴露的脊髓與周圍組織形成一個(gè)小池。游離同側(cè)后肢坐骨神經(jīng)約1.5 cm，并將刺激電極置于游離出坐骨神經(jīng)上。在大鼠坐骨神經(jīng)暴露處定時(shí)滴加液體石蠟，以防坐骨神經(jīng)干燥。術(shù)后用三碘季胺酚（40 mg/kg）制動(dòng)，用溫控儀將動(dòng)物肛溫維持在37.5℃左右，在維持麻醉下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)六組實(shí)驗(yàn)大鼠注射生理鹽水（5 μL）、CBT（20、40、80 ng/kg）、阿托品（2 mg/kg）、阿托品（2 mg/kg）+CBT（40 ng/kg）。隨時(shí)觀察大鼠肢端皮膚色澤，同時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠心電圖，如若異常立即終止實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 穩(wěn)定記錄到脊髓背角廣動(dòng)力范圍（WDR）神經(jīng)元放電5 min后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，電刺激坐骨神經(jīng)作為傷害性刺激，以給予電刺激后WDR神經(jīng)元5 s的放電頻率（spikes/s）為指標(biāo)，分別記錄給藥前后的放電頻率，以給藥前傷害性刺激放電頻率為100%，給藥后的各時(shí)間點(diǎn)放電頻率折算成相對(duì)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Powerlab軟件（Chart V5.3）采集放電圖形并測(cè)量痛誘發(fā)放電頻率。應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同含量CBT對(duì)炎癥模型大鼠脊髓背角WDR神經(jīng)元痛誘發(fā)放電的影響 在大鼠脊髓表面滴注不同含量CBT對(duì)佐劑性炎癥大鼠脊髓背角WDR神經(jīng)元的痛誘發(fā)放電均有顯著的抑制效應(yīng)。CBT組（20 ng/kg）在給藥后30 min開(kāi)始產(chǎn)生明顯抑制作用，而40、80 ng/kg CBT組在給藥后20 min開(kāi)始產(chǎn)生顯著抑制作用，各組放電頻率與生理鹽水組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而且隨著CBT含量增加，對(duì)脊髓背角WDR神經(jīng)元痛誘發(fā)放電抑制率增高，且不同含量CBT組對(duì)脊髓背角WDR神經(jīng)元痛誘發(fā)放電的抑制率隨時(shí)間持續(xù)性增高。見(jiàn)圖1。

2.2 阿托品對(duì)CBT在炎癥模型大鼠脊髓背角WDR神經(jīng)元痛誘發(fā)放電的影響 阿托品組大鼠預(yù)先腹腔注射阿托品2 mg/kg 2 h后，其對(duì)炎癥大鼠脊髓背角WDR神經(jīng)元的痛誘發(fā)放電頻率與生理鹽水組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。阿托品+CBT組在給藥20、30、40、50、60 min后均顯著降低了對(duì)脊髓背角WDR神經(jīng)元痛誘發(fā)放電的抑制，放電頻率與CBT（40 ng/kg）組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖1 不同含量CBT對(duì)炎癥模型大鼠脊髓背角WDR神經(jīng)元痛誘發(fā)放電的影響

圖2 阿托品對(duì)CBT在炎癥模型大鼠脊髓背角WDR神經(jīng)元痛誘發(fā)放電的影響

3 討 論

痛覺(jué)信號(hào)在上行傳導(dǎo)的過(guò)程中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的每一個(gè)水平，都具有一定的整合功能。以往對(duì)眼鏡蛇神經(jīng)毒素在慢性炎癥疼痛的鎮(zhèn)痛作用鮮有報(bào)道。Liu等[7]用CFA建造模型（造模）引起大鼠持續(xù)炎癥疼痛并出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏，在造模成功后第11天開(kāi)始腹腔注射CBT能顯著抑制佐劑性炎癥大鼠的機(jī)械痛敏和熱痛敏，說(shuō)明CBT具有抗炎、減輕疼痛作用。近年來(lái)，隨著對(duì)慢性炎癥疼痛機(jī)制探究的深入，發(fā)現(xiàn)脊髓背角神經(jīng)元與慢性炎癥疼痛的發(fā)生和發(fā)展存在著緊密關(guān)系。大量的實(shí)驗(yàn)研究及臨床案例均已證實(shí)眼鏡蛇神經(jīng)毒素具有鎮(zhèn)痛作用[8-10]，但對(duì)于具體鎮(zhèn)痛機(jī)制的研究報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)是觀察不同濃度CBT對(duì)慢性炎癥痛模型大鼠脊髓背角的痛誘發(fā)放電的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度CBT對(duì)慢性炎癥痛模型大鼠脊髓背角的痛誘發(fā)放電均具有顯著抑制效應(yīng)，且具有一定的劑量依賴性，證實(shí)了其具有顯著鎮(zhèn)痛效果。

在痛覺(jué)信息傳遞及調(diào)制的生理過(guò)程中，神經(jīng)遞質(zhì)阿片肽、5-羥色胺、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、一氧化氮、腺苷三磷酸、腺苷、降鈣素基因相關(guān)肽等均參與了痛覺(jué)的調(diào)制。其中，ACh是最早被確定的神經(jīng)遞質(zhì)之一，其廣泛分布于大腦皮層、腦干和脊髓等部位。有文獻(xiàn)證明，擬膽堿類藥參與了針刺鎮(zhèn)痛過(guò)程，且鎮(zhèn)痛部位在中樞神經(jīng)而不是在外周神經(jīng)[11]。針刺鎮(zhèn)痛時(shí)中樞ACh合成釋放和更新率都升高，膽堿酯酶的活性提高；應(yīng)用藥物使ACh在一定部位的積聚可使鎮(zhèn)痛效應(yīng)加強(qiáng)，反之減弱。目前關(guān)注的蛇毒神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛部位主要位于中樞。腦室、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)微量注射蛇毒神經(jīng)毒素也可產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。蛇毒的鎮(zhèn)痛作用能在熱板法的實(shí)驗(yàn)（熱板法的行為反應(yīng)是一個(gè)脊髓以上高級(jí)中樞整合的反應(yīng)）中很好地反映出來(lái)，但有研究顯示，在大鼠的甩尾實(shí)驗(yàn)中，蛇毒神經(jīng)毒素?zé)o顯著鎮(zhèn)痛效應(yīng)，說(shuō)明蛇毒的鎮(zhèn)痛部位僅限于脊髓以上的高位水平，但也不能完全排除外周鎮(zhèn)痛的可能性[12]。

蛇毒神經(jīng)毒素鎮(zhèn)痛作用時(shí)間長(zhǎng)、效價(jià)高，且連續(xù)用藥后不耐受，明顯優(yōu)于阿片肽及其衍生物，屬于麻醉性鎮(zhèn)痛藥，CBT鎮(zhèn)痛作用是否與阿片肽受體有關(guān)尚有待于進(jìn)一步研究。有研究顯示，蛇毒神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛作用與中樞M膽堿能系統(tǒng)興奮有關(guān)[13-14]。為進(jìn)一步揭示CBT對(duì)慢性炎癥大鼠鎮(zhèn)痛的可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)使用了膽堿能受體拮抗劑阿托品，發(fā)現(xiàn)阿托品可以翻轉(zhuǎn)CBT對(duì)慢性炎癥大鼠的脊髓背角神經(jīng)元痛誘發(fā)放電的抑制作用，提示阿托品可以顯著翻轉(zhuǎn)CBT的鎮(zhèn)痛作用，從而表明CBT的鎮(zhèn)痛作用可能與膽堿能受體系統(tǒng)有關(guān)，至于其確切機(jī)制及其與阿片肽的關(guān)系尚有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1]殷方臣，鄭穎，邱薇，等.蛇毒神經(jīng)毒素研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29（8）：67-70.

[2]Chen ZX，Zhang HL，Gu ZL，et al.A long-form alpha-neurotoxin from cobra venom produces potent opioid-independent analgesia[J].Acta Pharmacol Sin，2006，27（4）：402-408.

[3]閔志雪，黃璐，孫瑤，等.皖南地區(qū)眼鏡蛇毒活性組分鎮(zhèn)痛效應(yīng)的初步研究[J].中國(guó)病理生理雜志，2013，29（1）：150-154.

[4]Zhang HL，Han R，Chen ZX，et al.Analgesic effects of receptin，a chemically modified cobratoxin from Thailand cobra venom[J].Neurosci Bull，2006，22（5）：267-273.

[5]Zhang HL，Han R，Gu ZL，et al.A short-chain alpha-neurotoxin from Naja naja atra produces potent cholinergic-dependent analgesia[J].Neurosci Bull，2006，22（2）：103-109.

[6]Ruan Y，Yao L，Zhang B，et al.Anti-inflammatory effects of Neurotoxin-Nna，a peptide separated from the venom of Naja naja atra[J].BMC Complement Altern Med，2013，13：86.

[7]Liu YL，Lin HM，Zou R，et al.Suppression of complete Freund′s adjuvantinduced adjuvant arthritis by cobratoxin[J].Acta Pharmacol Sin，2009，30（2）：219-227.

[8]Nogueira-Neto Fde S，Amorim RL，Brigatte P，et al.The analgesic effect of crotoxin on neuropathic pain is mediated by central muscarinic receptors and 5-lipoxygenase-derived mediators[J].Pharmacol Biochem Behav，2008，91（2）：252-260.

[9]王金保，王姝媛，王琪，等.眼鏡蛇毒因子對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角神經(jīng)元的保護(hù)效應(yīng)[J].臨床麻醉學(xué)雜志，2010，26（4）：333-335.

[10]Cheng BC，Zhou XP，Zhu Q，et al.Cobratoxin inhibits pain-evoked discharge of neurons in thalamic parafascicular nucleus in rats：involvement ofcholinergic and serotonergic systems[J].Toxicon，2009，54（3）：224-232.

[11]關(guān)新民，王才源，余湢，等.中樞乙酰膽堿與針刺鎮(zhèn)痛關(guān)系的研究[J].針刺研究，1991，16（2）：129-137.

[12]Picolo G，Giorgi R，Cury Y，et al.delta-opioid receptors and nitric oxide mediate the analgesic effect of Crotalus durissus terrificus snake venom[J]. Eur J Pharmacol，2000，391（1/2）：55-62.

[13]王海華，張根葆，閔志雪，等.皖南地區(qū)眼鏡蛇毒鎮(zhèn)痛組分對(duì)大鼠炎性痛作用機(jī)制探討[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2013，18（10）：1093-1099.

[14]梁映霞，張志宇，趙樹(shù)進(jìn).鞘內(nèi)注射眼鏡蛇毒活性成分對(duì)大鼠神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用[J].廣東醫(yī)學(xué)，2012，33（7）：909-911.

Analgesic effect of cobratoxin and its possible mechanism

Peng Jianming，Su Landi，Luo Xue，Ye Jilin，Yu Youjiang
（Medical College of Yangzhou Polytechnic College，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）

ObjectiveTo investigate the analgesic effect of cobratoxin（CBT）and its possible mechanisms.MethodsThe pain-evoked discharge from the spinal dorsal horn neurons in rats with chronic pain was recorded by the somatic extracellular record method.The 6 experimental rat groups were injected by the normal saline（5 μL），CBT（20，40，80 ng/kg），atropine（2 mg/kg）and atropine（2 mg/kg）+CBT（40 ng/kg）respectively.The influence of different concentrations of CBT on the pain-evoked discharge from the spinal dorsal horn neurons was observed.At the same time，whether cholinergic receptor antagonist atropine overturning its analgesic effect was observed too.ResultsThe different concentrations of CBT could obviously inhibit the pain-evoked discharge from the spinal dorsal horn neuron in rats with chronic pain，the discharge frequency had statistically significant difference betweenthe differentconcentrationandthe normalsaline group（P＜0.05），moreover the effect could be blocked by atropine，the difference of the discharge frequency at 20，30，40，50，60 min had statistical difference between the atropine+CBT group and the CBT40ng/kggroup（P＜0.05）.ConclusionCBT possesses a significantanalgesic effect，this effecthas certain dose dependence and the cholinergic receptor system participates in this analgesic process.

Cobra venoms； Cobra； Neurotoxins； Analgesia

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.19.003

A

1009-5519（2015）19-2896-03

2015-05-28）

關(guān)于醫(yī)學(xué)論文中的志謝

本刊編輯部

江蘇省衛(wèi)生廳衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)教育基金資助項(xiàng)目（NJ201112）；揚(yáng)州環(huán)境資源學(xué)院校級(jí)課題（N201129）。

彭建明（1984-），男，江蘇射陽(yáng)人，碩士研究生，講師，主要從事醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)、痛覺(jué)調(diào)制的研究；E-mail：shmily_peng@163.com。

于有江（E-mail：51229768@qq.com）。

在文后志謝是表示感謝并記錄在案的意思。對(duì)給予實(shí)質(zhì)性幫助而又不能列為作者的單位或個(gè)人應(yīng)在文后給予志謝。但必須征得被志謝人的書(shū)面同意。志謝應(yīng)避免以下傾向：（1）確實(shí)得到某些單位或個(gè)人的幫助，甚至用了他人的方法、思路、資料，但為了搶先發(fā)表，而不公開(kāi)志謝和說(shuō)明；（2）出于某種考慮，將應(yīng)被志謝人放在作者的位置上，混淆了作者和被志謝者的權(quán)利和義務(wù)；（3）以名人、知名專家包裝自己的論文，抬高論文的身份，將未曾參與工作的，也未閱讀過(guò)該論文的知名專家寫(xiě)在志謝中。被志謝者包括：（1）對(duì)研究提供資助的單位和個(gè)人、合作單位；（2）協(xié)助完成研究工作和提供便利條件的組織和個(gè)人；（3）協(xié)助診斷和提出重要建議的人；（4）給予轉(zhuǎn)載和引用權(quán)的資料、圖片、文獻(xiàn)、研究思想和設(shè)想的所有者；（5）作出貢獻(xiàn)又不能成為作者的人，如提供技術(shù)幫助和給予財(cái)力、物力支持的人，此時(shí)應(yīng)闡明其支援的性質(zhì)；（6）其他需志謝者。