何貴成，嚴(yán)思佳，丁 恩，艾小紅

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，湖南衡陽(yáng)421001）

8-硝基白楊素誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞分化研究

何貴成，嚴(yán)思佳，丁 恩，艾小紅

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，湖南衡陽(yáng)421001）

目的探討傳統(tǒng)中藥蜂膠的有效成分白楊素的人工半合成類似物8-溴-7-甲氧基白楊素，即8-硝基白楊素（BrMC）是否具有誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞分化作用。方法體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞，分別加入1.0μg/mL BrMC和1.0 μg/mL全反式維甲酸（ATRA），同時(shí)設(shè)溶媒對(duì)照組和空白對(duì)照組。瑞氏-姬姆薩染色法檢測(cè)BrMC誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞形態(tài)與核質(zhì)比的變化；酶促反應(yīng)試劑盒檢測(cè)BrMC和ATRA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中堿性磷酸酶（ALP）和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）的活性；放射免疫法檢測(cè)甲胎蛋白（AFP）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；Diamondstone分光光度法（速率法）檢測(cè)酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶（TAT）的活性。結(jié)果1.0 μg/mL BrMC處理的細(xì)胞核質(zhì)比遠(yuǎn)低于溶媒對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。1.0 μg/mL BrMC、ATRA組處理24、48、96 h的HepG2細(xì)胞液中AFP質(zhì)量分?jǐn)?shù)，γ-GT、ALP、TAT活性分別與溶媒對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論BrMC能降低HepG2細(xì)胞核質(zhì)比、減少HepG2細(xì)胞的AFP分泌、有效地活化HepG2細(xì)胞TAT、ALP；且BrMC和ATRA均能抑制HepG2細(xì)胞γ-GT活性。BrMC通過以上作用誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞分化。

植物提取物； 肝腫瘤/病理學(xué)； 腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)的； 8-硝基白楊素； HepG2細(xì)胞； 分化； 誘導(dǎo)

肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一。肝癌在我國(guó)發(fā)病率高，占全球50%以上[1-2]。而目前提高肝癌療效大多傾向于依賴藥物治療，現(xiàn)有的常規(guī)化療藥物選擇性低、毒性作用嚴(yán)重，且單藥有效率很少超過25%[3]。因此，尋找選擇性高的抗肝癌藥物，仍是肝癌防治研究的重要方向。近年來，隨著癌細(xì)胞再分化概念的提出，惡性腫瘤的誘導(dǎo)分化治療已成為腫瘤生物學(xué)和腫瘤治療學(xué)的研究熱點(diǎn)和前沿領(lǐng)域。白楊素（5，7-二羥黃酮，chrysin）是一種具有廣泛藥理活性的天然黃酮類化合物，在蜂膠和蜂蜜中含量較高，并在多種惡性腫瘤中具有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，例如乳腺癌[4-5]。但基于白楊素的口服生物利用度差，其口服制劑被用于臨床腫瘤防治的可能性不大[6]。8-硝基白楊素（8-溴-7-甲氧基白楊素，BrMC）作為白楊素的一種新衍生物，具有良好的抗腫瘤作用。目前，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，BrMC對(duì)腫瘤干細(xì)胞也有重要作用，BrMC能通過下調(diào)看家基因（βcatenin）抑制肝癌干細(xì)胞性能[7]。而目前有關(guān)BrMC誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞分化作用鮮有報(bào)道。

本研究擬體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞，通過瑞氏-姬姆薩染色法觀察BrMC是否具有誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞分化作用，試圖尋求具有高效的、毒性作用小的治療人肝癌的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。BrMC由南華大學(xué)藥學(xué)系鄭興教授惠贈(zèng)，性狀：黃色晶體；純度大于98%。全反式維甲酸（ATRA）購(gòu)自Sigma公司。二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；吉姆薩染液購(gòu)自Sigma公司；胰酶消化液購(gòu)自碧云天生物試劑有限公司；其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 人肝癌HepG2細(xì)胞核質(zhì)比的測(cè)量 將清潔滅菌的22 mm×22 mm載玻片置6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁，吸棄培養(yǎng)基，加入含1.0 μg/mL BrMC和1.0 μg/mL ATRA的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h。取出載玻片，進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，測(cè)量細(xì)胞核質(zhì)比。

1.2.2 細(xì)胞特異性酶和蛋白的測(cè)定 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞每毫升2×104個(gè)接種于50 mL培養(yǎng)瓶，每瓶1 mL，分別加入1.0μg/mLBrMC和1.0μg/mLATRA，同時(shí)設(shè)溶媒對(duì)照組[0.1%乙醇（EtOH）]、空白對(duì)照組，每組3個(gè)平行瓶，培養(yǎng)96 h后分別收集不同時(shí)期（0、24、48、96 h）細(xì)胞和培養(yǎng)液。采用超聲破碎法裂解細(xì)胞，放射免疫法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液的甲胎蛋白（AFP）質(zhì)量分?jǐn)?shù)；酶促反應(yīng)試劑盒檢測(cè)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）和堿性磷酸酶（ALP）的活性；Diamondstone分光光度法（速率法）測(cè)定酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶（TAT）的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用Students′t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BrMC對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞核質(zhì)比的影響 1.0μg/mL BrMC處理的細(xì)胞核質(zhì)比為（0.16±0.06），比同質(zhì)量濃度的ATRA[（0.15±0.03）]略高，遠(yuǎn)低于溶媒對(duì)照組[（0.34± 0.06）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明BrMC具有很強(qiáng)地誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞分化的能力。見圖1。

圖1 BrMC對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞核質(zhì)比的影響

2.2 BrMC對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞AFP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

1.0 μg/mL BrMC處理0、24、48、96 h后HepG2細(xì)胞液中AFP質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（302±12）、（224±8）、（131±5）、（83±2）μg/g，1.0 μg/mL ATRA處理0、24、48、96 h后HepG2細(xì)胞液中AFP質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（318±10）、（214±9）、（150± 06）、（112±2）μg/g；溶媒對(duì)照組處理 0、24、48、96 h后HepG2細(xì)胞液中AFP質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（300±10）、（292±9）、（320±4）、（308±10）μg/g。1.0 μg/mL BrMC、ATRA組處理24、48、96 h后HepG2細(xì)胞液中AFP質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別與溶媒對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明BrMC能有效減少HepG2細(xì)胞的AFP分泌。見圖2。

圖2 BrMC對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞AFP含量的影響

2.3 BrMC對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞γ-GT活性的影響1.0 μg/mL BrMC處理0、24、48、96 h后HepG2細(xì)胞液中γ-GT的活性分別為（68±5）、（46±3）、（33±3）、（23±1）U/g；1.0 μg/mL ATRA處理0、24、48、96 h后HepG2細(xì)胞液中γ-GT的活性分別為（68±4）、（29±3）、（22±1）、（17±1）U/g；溶媒對(duì)照組處理0、24、48、96 h后HepG2細(xì)胞液中 γ-GT的活性分別為（68±2）、（64±2）、（67±1）、（63±1）U/g。1.0 μg/mL BrMC、ATRA組處理 24、48、96 h后 HepG2細(xì)胞液中γ-GT活性分別與溶媒對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明BrMC和ATRA均能抑制HepG2細(xì)胞GGT活性。見圖3。

圖3 BrMC對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞γ-GT活性的影響

2.4 BrMC對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞ALP活性的影響1.0 μg/mL BrMC處理0、24、48、96 h后HepG2細(xì)胞液中ALP的活性分別為（349±12）、（576±15）、（870±31）、（1 185±46）U/g；1.0 μg/mL ATRA處理 0、24、48、96h后HepG2細(xì)胞液中ALP的活性分別為（349±10）、（680± 20）、（870±31）、（1 288±58）U/g；溶媒對(duì)照組處理0、24、48、96 h后HepG2細(xì)胞液中ALP的活性分別為（349±12）、（347±12）、（350±31）、（352±46）U/g。1.0 μg/mL BrMC、ATRA組處理24、48、96 h后HepG2細(xì)胞液中ALP活性分別與溶媒對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明BrMC和ATRA均能提高HepG2細(xì)胞ALP活性。見圖4。

圖4 BrMC對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞ALP活性的影響

2.5 BrMC對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞TAT活性的影響1.0 μg/mL BrMC處理0、24、48、96 h后HepG2細(xì)胞液中TAT的活性分別為（15.0±1.0）、（25.0±1.6）、（35.0±2.1）、（48.0±2.4）U/g；1.0 μg/mL ATRA處理 0、24、48、96 h后HepG2細(xì)胞液中TAT的活性分別為（17.0±0.8）、（24.5± 1.4）、（34.0±2.0）、（45.0±2.2）U/g；溶媒對(duì)照組處理0、24、48、96 h后HepG2細(xì)胞液中TAT的活性分別為（15.0± 0.8）、（17.0±0.8）、（15.0±0.8）、（17.6±1.0）U/g。1.0 μg/mL BrMC、ATRA組處理24、48、96 h后HepG2細(xì)胞液中TAT活性分別與溶媒對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明BrMC能夠有效地活化HepG2細(xì)胞TAT。見圖5。

圖5 BrMC對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞TAT活性的影響

3 討 論

一般認(rèn)為，癌細(xì)胞是細(xì)胞在早期分化階段被致癌物轉(zhuǎn)化為低分化、高增殖的細(xì)胞；而在細(xì)胞接近于分化完成時(shí)，被致癌物轉(zhuǎn)化為高度分化的、低增殖的細(xì)胞。不管癌細(xì)胞是來自成熟細(xì)胞的反分化或來自未成熟細(xì)胞的異常分化，還是阻抑正常細(xì)胞的分化，都可以看作是一種細(xì)胞分化的疾病，目前已被證實(shí)有許多生成因子或化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)或體外可促進(jìn)癌細(xì)胞分化而降低腫瘤惡性程度的事實(shí)，為發(fā)展抗癌治療開辟了一條新途徑──分化誘導(dǎo)治療[8]。

腫瘤細(xì)胞分化誘導(dǎo)治療是指在一些化學(xué)制劑的作用下，不殺傷腫瘤細(xì)胞，而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化為正?；蚪咏＜?xì)胞表型，以促進(jìn)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞分化來治療癌癥。隨著ATRA治療人急性早幼粒細(xì)胞白血病獲得顯著療效后，分化誘導(dǎo)療法已成為國(guó)際腫瘤研究的新熱點(diǎn)。Reddi等[9]研究結(jié)果顯示，PAX8/過氧化物酶體增殖因子活化受體γ（PPARγ）融合蛋白的表達(dá)可顯著促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞中PAX8、甲狀腺過氧化物酶（TPO）、鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)（NIS）和甲狀腺球蛋白的過表達(dá)，從而誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞的再分化，抑制甲狀腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)；Haghpanah等[10]的體外研究表明，丙戊酸可誘導(dǎo)未分化甲狀腺癌細(xì)胞再分化，也能降低甲狀腺癌的腫瘤干細(xì)胞特性。因此，尋找高效、低毒分化誘導(dǎo)劑已成為藥物化療腫瘤的重點(diǎn)方向。

最新數(shù)據(jù)顯示，BrMC能通過不同的作用機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用。例如BrMC能顯著抑制HER-2/neu-乳腺癌的增殖活性[11]；也可通過與噻唑烷酮類化合物不同結(jié)合的方式，激活PPARr抑制環(huán)氧醇2（COX-2）的活性[12]。

近30年來，隨著癌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和分化治療的發(fā)展，但有關(guān)肝癌細(xì)胞的分化研究報(bào)道尚不多。黃煒等[13]研究證實(shí)，丁酸鈉（SB）處理肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞核質(zhì)比明顯減小，鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（OCT）、TAT和ALP活性明顯升高，AFP分泌量和γ-GT活力明顯下降，表明SB可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞再分化。ATRA是公認(rèn)的細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，在治療人急性早幼粒細(xì)胞白血病方面已獲得顯著療效。最近研究發(fā)現(xiàn)，ATRA可降低SMMC-7721細(xì)胞的AFP分泌量和γ-GT活性，升高ALP和加強(qiáng)TAT活性，增加清蛋白的分泌量[14-15]。AFP和γ-GT是2個(gè)公認(rèn)的人類肝癌的標(biāo)志物，而ALP和TAT只有在成熟分化的肝細(xì)胞中表達(dá)，是肝細(xì)胞成熟分化的標(biāo)志。這些研究結(jié)果在體外細(xì)胞培養(yǎng)水平上證明了ATRA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的諸多惡性表型具有逆轉(zhuǎn)作用。因此，本研究擬體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，BrMC作為處理因子，通過與細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑（ATRA）對(duì)比，觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)與核質(zhì)比的變化、檢測(cè)細(xì)胞中ALP和γ-GT活性的變化及AFP質(zhì)量分?jǐn)?shù)、TAT活性，以證實(shí)BrMC是否對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞存在誘導(dǎo)再分化作用。

眾所周知，肝癌細(xì)胞分化不良在形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為細(xì)胞明顯增大，染色深，核大，核圓呈多型，核質(zhì)比失常[16-17]。本研究在體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中分別加入1.0 μg/mL BrMC和1.0 μg/mL ATRA后，通過瑞氏-姬姆薩染色，光鏡顯微鏡下測(cè)量發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核質(zhì)比明顯降低。提示BrMC具有誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2分化的效應(yīng)。為探討肝癌細(xì)胞分化的指標(biāo)，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，選用了4種可以反映肝細(xì)胞分化的酶和蛋白作為觀察對(duì)象。γ-GT和TAT均是肝癌的標(biāo)志酶，γ-GT主要分布于肝、胰等組織，參與γ-谷氨酰循環(huán)，與肝癌的分化程度呈負(fù)相關(guān)，后者則呈正相關(guān)[18]。AFP是胎肝、再生肝及肝癌細(xì)胞所產(chǎn)生的一種癌胚蛋白，其量的多少反映肝細(xì)胞去分化程度的高低，是公認(rèn)的肝癌腫瘤標(biāo)志[19]。ALP是成熟肝細(xì)胞分泌的蛋白，可作為肝細(xì)胞分化的標(biāo)記蛋白[20]。本研究結(jié)果提示，BrMC能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞分化，逆轉(zhuǎn)其惡性表型。BrMC具有誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞分化的活性。

因此，本研究結(jié)果證實(shí)，傳統(tǒng)中藥蜂膠的有效成分白楊素的類似物BrMC能降低HepG2細(xì)胞核質(zhì)比、減少HepG2細(xì)胞的AFP分泌及有效地活化HepG2細(xì)胞TAT、ALP；且BrMC和ATRA均能抑制HepG2細(xì)胞γ-GT活性。BrMC通過以上作用誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞分化。但值得注意的是，分化的觀察指標(biāo)應(yīng)是一個(gè)綜合性指標(biāo)，單獨(dú)觀察其中任一項(xiàng)指標(biāo)，均無法證明腫瘤細(xì)胞的分化，而應(yīng)綜合觀察細(xì)胞的形態(tài)、功能及生物學(xué)行為3個(gè)方面的指標(biāo)。隨著腫瘤干細(xì)胞學(xué)說的提出，作者認(rèn)為，腫瘤的本質(zhì)是一種干細(xì)胞疾病，于是設(shè)想BrMC可能首先是通過誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化，進(jìn)而抑制肝癌干細(xì)胞自我更新，但尚有待于另外申報(bào)研究項(xiàng)目進(jìn)行探索。

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Study on BrMC induced differentiation of human hepatocarcinoma HepG2 cells

He Guicheng，Yan Sijia，Ding En，Ai Xiaohong
（Department of Oncology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang，Hunan 421001，China）

ObjectiveTo evaluate whether the artificial semisynthetic analogue 8-bromo-7-methoxychrysin（BrMC），i. e.，8-nitrochrysin as an effective component of traditional Chinese medicine propolis，having the ability for inducing the differentiation of human hepatocarcinoma cells.MethodsThe human hepatocarcinoma HepG2 cells were cultured in vitro.The Wright s-Giemse mixed coloring method was adopted to detect the changes of the cellular morphology and the nuclear-cytoplasmic ratio of Hep G2 cells induced by BrMc；the changes of microtubules microfilament protein array of HepG2 cells induced by BrMC and all transretinoidacid（ATRA）wereobservedbyCoomassiebrilliantblue staining；the contentsof alkaline phosphatase（ALP）andgammaglutamyl transpeptidase（γ-GT）in HepG2 cells were detected by the enzyme catalyzed reaction；the radioimmunoassay（RIA）was used to detect the mass fraction of alpha fetal protein（AFP）；the content of tyrosine transaminase（TAT）was measured by the Diamondstone spectrophotometry.ResultsThe cytoplasmic ratio by 1.0 ug/mL BrMC handled was far lower than that of solvent con trol group，the difference was statistically significant（P＜0.01）.1.0 μg/mL BrMC and ATRA handled 24，48，96 hours，the mass fraction of AFP，activity of γ-GT，ALP，TAT compared with the solvent control group respectively，the difference were statistically significant（P＜0.01）.ConclusionBrMC induces human hepatocarcinoma cellular differentiation by lowing the nucleus-cytoplasmic ratio，decreasing the secretion of AFP，effectively activating TAT and ALP in HepG2 cells；moreover BrMc and ATRA inhibiting the activity of γ-GT.

Plantextracts； Liver neoplasms/pathology； Tumor cells，cultured； 8-bromo-7-methoxychrysin（BrMC）；HepG2cells； Differentiation； Induce

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.19.002

A

1009-5519（2015）19-2892-04

2015-05-05）

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何貴成（1987-），女，湖南衡陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事臨床實(shí)體瘤的診治與防治工作；Email：313397526@qq.com。

艾小紅（E-mail：1163504926@qq.com）。