宋 麗，陳安林，陳澤慧，董澤令，楊 歡，陳先戀

（1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000）

耐亞胺培南鮑曼不動桿菌OXA基因檢測及同源性分析

宋 麗1，陳安林2，陳澤慧2，董澤令2，楊 歡2，陳先戀2

（1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000）

目的了解耐亞胺培南鮑曼不動桿菌（IRAB）的耐藥性、OXA基因型及同源性，為臨床用藥提供參考并有效控制醫(yī)院內(nèi)感染。方法收集2013年12月至2014年7月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床分離的65株IRAB，經(jīng)VITEK 2 Compact進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗，另采用紙片擴散法進(jìn)行米諾環(huán)素（MH）、多黏菌素B（PB）、頭孢哌酮/舒巴坦藥敏試驗；多重PCR方法檢測OXA基因型；采用腸桿菌科間重復(fù)一致序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ERIC-PCR）分析其同源性。結(jié)果65株IRAB對PB未出現(xiàn)耐藥菌株，且對MH敏感率為59.8%（39/65），其他抗菌藥物的耐藥率均在70.0%以上；65株IRAB中均檢出攜帶OXA-23和OXA-51基因，其對照組對亞胺培南敏感的鮑曼不動桿菌（ISAB）僅檢出OXA-51基因；ERIC-PCR同源性結(jié)果顯示，該院IRAB有3個克隆型，其中以A、B型為主，主要分布在ICU，分別占67.5%（27/40）、57.9%（11/19）。結(jié)論該院IRAB耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，OXA-23是其主要基因型，且存在科室間克隆播散。

鮑氏不動桿菌； 亞胺培南； 基因； OXA基因； 同源性

鮑曼不動桿菌（Ab）為不發(fā)酵糖類氧化酶陰性的革蘭陰性條件致病菌，在自然界分布廣泛，是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一，易引起嚴(yán)重甚至致死性的感染，如呼吸機相關(guān)性肺炎、敗血癥等。據(jù)文獻(xiàn)報道，Ab感染后死亡率也在逐年升高，在ICU患者中達(dá)10.0%～43.0%[1]。近年來，Ab的耐藥性呈逐漸上升趨勢，尤其是出現(xiàn)了耐碳青霉烯類抗菌藥物的菌株，已成為臨床抗感染治療的一個難點[2]。本研究收集遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床分離的65株耐亞胺培南鮑曼不動桿菌（IRAB），回顧性分析其耐藥性、OXA基因型及同源性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2013年12月至2014年7月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床分離的IRAB 65株（同一患者無重復(fù)菌株），標(biāo)本來源包括痰液、創(chuàng)面分泌物、靜脈血、腹腔引流物等。

1.1.2 試劑與儀器 法國梅里埃公司的VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀及配套鑒定卡和藥敏卡；英國Oxoid公司的藥敏紙片[米諾環(huán)素（MH）30 μg、多黏菌素B（PB）300 μg、頭孢哌酮/舒巴坦（SCF）105 μg]；北京博邁德生物有限公司的DNA提取試劑盒，預(yù)混有Taq、dNTP、Taq緩沖液及鎂離子的混合劑（Mix）、DNAmaker，OXA基因型引物及腸桿菌科間重復(fù)一致序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ERIC-PCR）引物；美國BioRad公司的PCR擴增儀、電泳儀；美國SYNGENE公司的凝膠成像儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗 采用紙片擴散法進(jìn)行MH、PB、SCF藥敏試驗，其他抗菌藥物使用法國梅里埃公司的VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀及GN配套鑒定卡（革蘭陰性桿菌鑒定卡）和藥敏卡進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果解釋參照2012年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)判斷。以大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853作為質(zhì)控菌株。

1.2.2 OXA基因型檢測 采用北京博邁德生物有限公司DNA提取試劑盒提取DNA模板，運用4對引物對其進(jìn)行多重PCR擴增[3]，引物序列見表1。反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃25s，53℃40s，72℃50 s，共30個循環(huán)，72℃最終延伸6 min。擴增產(chǎn)物置于2.0%瓊脂糖凝膠電泳，然后在美國SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析。

表1 多重PCR引物序列

1.2.3 ERIC-PCR同源性分析 65株IRAB進(jìn)行ERICPCR同源性分析，引物序列為ERIC1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′；ERIC2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′[4]。PCR反應(yīng)體系為 25 μL，DNA模板1 μL，引物2 μL（上、下游引物各1 μL），Mix 12.5 μL，雙蒸水9.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，92℃1min，52℃1 min，70℃5 min，共35個循環(huán)，70℃最終延伸10 min。擴增產(chǎn)物置于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，最后在美國SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析。電泳結(jié)果分型：條帶數(shù)目相同且位置相同，忽略其條帶密度定為同一型，按A、B、C字母表示不同型別[5]。

1.3 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用WHONET5.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 65株IRAB藥敏試驗結(jié)果 65株IRAB對多種抗菌藥物有很高的耐藥性，但對PB未出現(xiàn)耐藥菌株，且對MH也有較高的敏感性，對其他抗菌藥物的耐藥率均在70.0%以上。見表2。

表2 65株IRAB藥敏試驗結(jié)果[n（%）]

2.2 OXA基因型檢測 65株IRAB菌株中，經(jīng)多重PCR凝膠電泳分析，均檢出攜帶OXA-23和OXA-51基因，但未檢測到攜帶OXA-24、OXA-58基因，部分電泳結(jié)果見圖1（A組）。對照組為臨床分離的對亞胺培南敏感的鮑曼不動桿菌（ISAB），僅檢出OXA-51基因，部分電泳結(jié)果見圖1（B組）。

圖1 OXA基因型檢測（多重PCR凝膠電泳圖）

2.3 ERIC-PCR同源性分析 65株 IRAB經(jīng)ERICPCR同源性分析，結(jié)果顯示出3個克隆型，其中A型40株，在2 000～1 000、1 000～750、750～500、250～100 bp分別有1條條帶，在500～250 bp有2條條帶，共6條條帶；B型19株，缺少在250～100 bp的1條條帶；C型6株，缺少在250～100 bp和500～250 bp的2條條帶，部分電泳圖見圖2。

圖2 ERIC-PCR同源性分析（凝膠電泳圖）

2.4 65株IRAB同源性分型與科室分布 65株IRAB檢測出的A、B、C型中，主要分布在ICU，共39株，占60.0%，其余科室占40.0%。40株A型中，ICU有27株，占67.5%；19株B型中，ICU有11株，占57.9%；6株C型主要分布在小兒內(nèi)科[50.0%（3/6）]。見表3。

表3 65株IRAB同源性分型與科室分布（株）

3 討 論

近年來，Ab成為遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)最常見的致病菌，其引起的感染發(fā)生率和病死率也在逐年上升，已成為最難治療和控制的醫(yī)院內(nèi)獲得性感染。

碳青霉烯類抗菌藥物——亞胺培南曾是治療Ab感染的有效藥物，但隨著臨床大量頻繁使用，日常微生物工作中已出現(xiàn)大量IRAB，而Ab一旦對亞胺培南耐藥，則會出現(xiàn)對臨床大多抗菌藥物均產(chǎn)生耐藥，繼而產(chǎn)生大量的多耐藥菌，甚至泛耐藥Ab。本研究中，65株IRAB對多種抗菌藥物均有很高的耐藥性，但對PB未出現(xiàn)耐藥菌株，對MH也有較高的敏感性（59.8%），對其他抗菌藥物的耐藥率均在70.0%以上。進(jìn)而提示本院醫(yī)務(wù)工作者對PB和MH在治療Ab感染時的使用上一定應(yīng)謹(jǐn)慎。當(dāng)然，在臨床上可以使用多聯(lián)的抗菌藥物，其抗菌療效較單一藥物好。據(jù)文獻(xiàn)報道，SCF聯(lián)合MH對泛耐藥Ab引起的呼吸道感染具有一定療效[6]。

Ab對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥機制主要包括：外膜孔蛋白丟失、外排泵的激活、青霉素結(jié)合蛋白的改變、碳青霉烯酶的產(chǎn)生等，其中以碳青霉烯酶的產(chǎn)生為其主要機制。耐碳青霉烯類抗菌藥物Ab往往以產(chǎn)生D類苯唑西林酶（OXA型酶）為主。據(jù)文獻(xiàn)報道，我國IRAB OXA-23基因的檢出率約為80.0%[7]，而本研究中，IRAB OXA-23基因的檢出率為100.0%。而對照組ISAB中則未檢出OXA-23基因，僅檢出了OXA-51基因。Brown等[8]于2004年首次在Ab中發(fā)現(xiàn)了OXA-51基因，其不同于其他類型的OXA型酶，主要是因為其存在于染色體上，是Ab的固有基因型，具有很高的種屬特異性，可以作為Ab檢測的標(biāo)志物[9]。本研究中，65株IRAB也均檢出了OXA-51基因，同時對照組ISAB中也均檢出了OXA-51基因，較好地驗證了OXA-51是Ab的固有基因型這一說法。另外，Ab特有的插入序列ISABa1常與OXA-23、OXA-51基因關(guān)系緊密，其可以提供強啟動子，在很大程度上能夠增強這些耐藥基因的高水平表達(dá)，從而介導(dǎo)Ab對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的高水平耐藥，本課題組后期可以進(jìn)一步研究這些耐藥基因與抗菌藥物之間的相互關(guān)系。

據(jù)文獻(xiàn)報道，同一病區(qū)2例以上患者或不同病區(qū)2例以上患者分離出相同基因型的Ab，可確診為醫(yī)院內(nèi)感染的局部小流行或醫(yī)院內(nèi)流行[10]。對臨床菌株進(jìn)行基因同源性分析，對于流行病學(xué)調(diào)查，特別是對傳染源和傳播途徑的追蹤具有很重要的意義。ERIC片段是許多革蘭陰性桿菌中存在的一段重復(fù)序列，其分布于基因組中，遺傳穩(wěn)定性在不同種間僅有位置和拷貝數(shù)的不同。ERIC-PCR方法較為簡便，無需特殊儀器和試劑，重復(fù)性較好，是醫(yī)院內(nèi)感染分子流行病學(xué)中較為理想的分析方法。本院65株IRAB的ERIC-PCR同源性分析結(jié)果顯示，ICU有67.5%A型和57.9%B型，說明ICU中的IRAB存在著A、B這2種克隆型的傳播，分析原因，可能與ICU患者機體抵抗力較差、合并較嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病、住院時間長、大量使用廣譜抗菌藥物導(dǎo)致多重耐藥菌株的產(chǎn)生，而且患者多有氣管插管、機械通氣史，為耐藥菌株提供了傳播途徑有關(guān)。另外，小兒內(nèi)科、神經(jīng)外科也存在著3種克隆型。醫(yī)務(wù)人員應(yīng)引起高度重視，采取有效措施，預(yù)防和監(jiān)控Ab的感染，及時阻斷多重耐藥菌的傳播。

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Oxacillinase gene detection of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii and homology analysis

Song Li1，Chen Anlin2，Chen Zehui2，Dong Zeling2，Yang Huan2，Chen Xianlian2
（1.Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；2.Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563000，China）

ObjectiveTo understand the drug resistance，oxacillinase（OXA）genotypes and homology of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii（IRAB）so as to provide reference for clinical medication and effective control of nosocomial infections.MethodsA total of 65 strains of IRAB clinically isolated in our hospital from December 2013 to July 2014 were collected and performed the bacterial identification and drug sensitivity testing by the VITEK 2 Compact system.The Kirby-Bauer（K-B）method was adopted to conduct the drug sensitivity testing to minocycline（MH），polymyxin B（PB）and cefoperazone/sulbactam.The OXA genotypes were detected by multiplex polymerase chain reaction（PCR）.Their homology was analyzed by enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences（ERIC）-PCR.Results65 strains of IRAB did not have the emergence of resistant strains to PB and their sensitivity rate to MH was 59.8%（39/65），but the resistance rates to other antimicrobial agents were more than 70.0%.Among 65 strains of IRAB，the gene carrying OXA-23 and OXA-51 was detected，and only OXA-51 gene was detected in the control groups of imipenem-sensitive Acinetobacter baumannii（ISAB）；the homology by ERIC-PCR showed that there were three clones types of IRAB in this hospital，in which the type A and B were predominant and mainly distributed in ICU，accounting for 67.5%（27/40）and 57.9%（11/19）respectively.ConclusionThe drug resistance of IRAB is serious in our hospital.OXA-23 is the main genotype of IRAB and its cloning spread exists between departments.

Acinetobacter baumannii； Imipenem； Genes； OXA genetype； Homology

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.19.001

A

1009-5519（2015）19-2889-03

2015-06-05）

貴州省科技廳基金資助項目（黔科合J字[2010]2215號）；遵義醫(yī)學(xué)院基金資助項目（院字[2009]22號）。

宋麗（1984-），女，山西運城人，碩士研究生，主要從事細(xì)菌耐藥機制的研究；E-mail：490961939@qq.com。

陳澤慧（E-mail：czhtyb@163.com）。