嚴忠雍 張小軍 李奇富 王瑩 柳家鵬龍舉 祝銀 楊會成

1(浙江省海洋水產(chǎn)研究所，舟山316021)

2(江蘇美正生物科技有限公司，無錫214135)

3(浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術研究重點實驗室，舟山316021)

4(浙江省海洋開發(fā)研究院，舟山316021)

1 引言

河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一種天然海洋生物神經(jīng)毒素，分布廣泛，主要存在于河豚魚中，圓尾鱟、藍環(huán)章魚、螺類等其它海洋生物中也有存在。河豚毒素毒性極強，食用0.5 mg 就可致人死亡，其帶正電荷的胍基能伸入鈉通道的離子選擇過濾器，和通道內(nèi)壁上的游離羧基結合，阻礙Na+進入，從而抑制神經(jīng)沖動的傳導，使人感覺神經(jīng)麻痹，四肢癱瘓，呼吸困難，最后因呼吸抑制而死亡［1～4］。我國每年都有因食帶有TTX 的海洋生物而導致中毒的事件發(fā)生。鑒于河豚毒素的嚴重危害，有必要建立一種簡便、快速有效檢測河豚毒素的方法。目前，河豚毒素的檢測方法有生物測定法［5］、高效液相色譜法(HPLC)［6，7］、液相色譜串聯(lián)質譜法(LC-MS)［8～11］及酶聯(lián)免疫法(ELISA)［12］等。其中，生物測定法一般需要專門動物，適用性差，且操作繁瑣，費時費力重復性差;酶聯(lián)免疫法雖特異性強，但酶聯(lián)免疫反應耗時長，操作難度較大;液相色譜串聯(lián)質譜法靈敏度高，但現(xiàn)有的文獻方法檢出限偏高，前處理復雜，且采用的固相萃取技術凈化樣品不理想、易受基質干擾，回收率低。免疫親和柱(IAC)是一種基于抗原抗體反應的新型層析柱，利用生物大分子具有對一類生物大分子特異識別和可逆結合的特性制作而成，具有獨特的選擇專一性和良好的吸附凈化性能。目前，尚未見以免疫親和柱作為前處理凈化手段檢測河豚毒素的相關報道，本實驗基于液相色譜串聯(lián)質譜的高靈敏性和精確性，利用免疫親和柱的獨特選擇識別性，建立一種快速、簡便、高效測定海洋生物中河豚毒素的分析方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITY 超高效液相色譜-質譜儀Quattro Premier XE(美國Waters 公司);MS2 漩渦混合器(德國IKA 公司);N-EVAP-112 氮吹儀(美國Organomation 公司);Centrifuge5810 高速離心機(德國Eppendorf公司);12 通道固相萃取裝置(美國Supelco 公司)。

TTX 標準品(純度≥98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司);TTX 免疫親和柱(柱容量3 mL，北京華安麥科生物技術有限公司);乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck 公司);乙酸銨、甲酸(美國Sigma 公司);乙酸、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl、NaOH(上海國藥集團);實驗用水均為超純水。

2.2 溶液的配制

TTX 標準溶液:準確稱取5.00 mg TTX 標準品，用0.1%甲酸-乙腈(1∶1，V/V)溶液溶解并定容至50 mL，4 ℃避光保存，保存期限為6 個月;使用時逐級用0.1%甲酸-乙腈溶液(1∶ 1，V/V)稀釋至100 μg/L。磷酸鹽緩沖液(PBS):分別稱取Na2HPO4·12H2O 6.45 g，NaH2PO2·2H2O 1.09 g，NaCl 4.25 g，用水溶解并定容至500 mL。

2.3 色譜及質譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH Amide 柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);樣品室溫度10 ℃;柱溫40 ℃;進樣體積10 μL;流速0.3 mL/min;流動相A 為含0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸銨溶液，B 為乙腈，梯度洗脫:0 ～1.5 min，5% ～80% A;1.5 ～3.0 min，80% A;3.0 ～3.5 min，80% ～5% A;3.5 ～5 min，5% A。

質譜條件:電噴霧離子源，正離子掃描(ESI +);檢測方式:多反應監(jiān)測(MRM);毛細管電壓:3.0 kV;離子源溫度:110 ℃;脫溶劑氣溫度:350 ℃;錐孔氣流量:50 L/h;脫溶劑氣流量:600 L/h;錐孔電壓、碰撞能量、分析物母離子及子離子等質譜多反應監(jiān)測實驗條件如表1 所示。

表1 河豚毒素的質譜多反應監(jiān)測實驗條件Table 1 Conditions of multiple reaction monitoring for tetrodotoxin (TTX)

2.4 樣品處理

2.4.1 樣品提取 稱取已充分均質樣品2.00 g 于50 mL 具塞離心管中，加入10 mL 含有1%乙酸的甲醇溶液，渦旋振蕩2 min，60 ℃水浴超聲提取15 min，冷卻至室溫后，6000 r/min 離心5 min。移取5 mL 上清液至另一個50 mL 離心管中，加入20 mL PBS 溶液稀釋，用1 mol/L NaOH 調(diào)至pH 7 ～8，待凈化。

2.4.2 免疫親和柱凈化 取出免疫親和柱，待回至室溫，去掉親和柱堵頭，放出柱內(nèi)保存液后，上樣品液。上樣結束后，用8 mL 水淋洗親和柱，擠干柱內(nèi)殘留液，并棄去以上全部流出液，最后用4 mL 含有1%乙酸的甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液于60℃氮氣吹干，用1 mL 流動相溶解并定容，經(jīng)0.22 μm 濾膜后供液相色譜-質譜分析。

3 結果與討論

3.1 色譜與質譜條件選擇

TTX 由于親水性和極性較強，在一般的反向色譜柱上不易保留，而ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜柱作為專用于強極性化合物分析的親水色譜柱，對TTX 保留性強，且具有較好的色譜峰形，滿足TTX液相色譜分析的需要。乙酸銨溶液能促進TTX 胍電離，并為陽離子的形成提供了質子來源，提高TTX離子化效率;甲酸能通過調(diào)節(jié)流動相pH 達到合適的分離效果，改善色譜峰形。本實驗研究比較了多組不同體積分數(shù)甲酸及不同濃度乙酸銨溶液對色譜分析的影響。結果表明，以0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸銨溶液與乙腈為流動相具有良好的色譜分離效果，且峰形尖銳對稱。

TTX 分子結構中具有帶正電荷的胍基，本實驗選擇在正離子掃描模式下用蠕動泵以3.0 mg/L 的TTX 標準溶液進行流動注射分析，對質譜參數(shù)進行優(yōu)化。通過一級質譜掃描分析，得到TTX 的分子離子，調(diào)試選擇最佳錐孔電壓和毛細管電壓，其中［M+H］+(m/z 320)豐度最高，從而可選擇離子m/z 320作為母離子進行檢測，如圖1 所示。對分析物離子進行二級質譜分析，獲取碎片離子信息，并對碰撞能量等質譜參數(shù)進行優(yōu)化，見表1。

3.2 提取試劑的選擇

TTX 是一種氨基全氫喹唑啉型化合物，只溶于酸性水或有機溶液。本實驗比較了乙腈和甲醇對TTX 的提取效率。乙腈作為常用的提取試劑，提取效率較好，但毒性較大;考慮到甲醇能迅速穿透組織，沉淀蛋白質，并具有脫水性，是提取TTX 的良好試劑。為考察TTX 提取所需的合適酸度，通過添加不同體積分數(shù)的乙酸獲取不同酸度的甲醇，比較不同酸度甲醇下提取得到的5 μg/L TTX 峰面積，結果如圖2 所示。當提取試劑中乙酸體積分數(shù)小于1%時，提取得到的TTX 峰面積隨乙酸的體積分數(shù)增加而增大;當體積分數(shù)大于1%后，峰面積基本保持不變，而過量的乙酸不利于調(diào)節(jié)樣品液pH 值，因此選擇含1%乙酸甲醇作為TTX 提取試劑。

圖1 TTX 一級質譜全掃描圖Fig.1 MS scan spectra of TTX

3.3 免疫親和柱條件優(yōu)化

免疫親和柱的親和結合作用與樣品液的pH 值直接相關，不適宜的pH 值會使親和作用減弱或破壞。本實驗采用HCl 和NaOH 調(diào)節(jié)樣品液pH 值，通過比較不同pH 值下TTX 的回收率，考察不同pH值下免疫親和柱的親和作用能力，結果如圖3 所示。當pH =7 ～8 時，親和作用能力最佳，TTX 回收率最高;當pH ＜6.5 或pH ＞9 時，親和能力明顯減弱，由此確定pH=7 ～8 時為TTX 免疫親和柱的最適宜pH 值。當使用8 mL 水淋洗親和柱時，雜質可基本除去，而TTX 未被洗脫下來;當4 mL 含有1%乙酸甲醇洗脫親和柱時，TTX 幾乎已完全洗脫，回收率也趨于穩(wěn)定。因此本實驗采用8 mL 水作為淋洗液，4 mL 含有1%乙酸甲醇作為洗脫液。

圖2 提取試劑酸度對TTX 提取效果的影響Fig.2 Effect of extraction reagent acidity on TTX extraction

本實驗還比較了MCX 柱、C18柱、SCX 柱與免疫親和柱對海洋生物的凈化效果，并考察4 種層析柱對TTX 回收率的影響。實驗結果表明，免疫親和柱對海洋生物樣品的凈化效果最好，目標峰能與雜峰有效分離，且響應強度高，回收率好，如圖4 所示。

圖3 樣品液pH 值對樣品中TTX 的回收率的影響Fig.3 Influence of pH on the recoveries of TTx in sample solution

3.4 線性范圍和定量限

用TTX 標準使用液配制濃度為0.3，1.0，2.0，5.0，10.0 和20.0 μg/L 標準工作溶液，峰面積-TTX 濃度標準曲線的線性回歸方程為y =72.2835x +13.5344(R2=0.9972)，TTX 在0.3 ～20.0 μg/L 范圍內(nèi)線性良好。以3 倍信噪比確定本方法的檢出限(LOD)為0.1 μg/kg，以10 倍信噪比確定本方法的定量限(LOQ)為0.3 μg/kg，如圖5 所示。本方法較文獻［10，11］檢出限更低，靈敏度提高了3 ～4 倍，適用于海洋生物中TTX 的檢測。

圖4 10 μg/kg 加標陰性樣品經(jīng)免疫親和柱凈化后的MRM 圖譜(a.定量離子對;b.定性離子對)Fig.4 MRM chromatograms of 10 μg/kg spiked sample cleaned up by IAC column(a.quantitative ion pair;b.qualitative ion pair)

圖5 TTX 定量限的MRM 圖(a.定量離子對;b.定性離子對)Fig.5 MRM chromatograms of quantification limit (a.quantitative ion pair;b.qualitative ion pair)

3.5 回收率和精密度

準確稱取2.00 g 陰性對蝦樣品，添加水平為0.30，1.50 和5.00 μg/kg 的TTX 標準溶液，每個添加水平平行測定6 次，計算回收率和精密度，結果見表2。TTX 在0.30 ～5.00 μg/kg添加水平的平均回收率88.7% ～102.3%，相對標準偏差為2.0% ～6.4%。

3.6 實際樣品分析

采用本方法對鷹爪蝦、對蝦、海鰻、荔枝螺、單齒螺、織紋螺、槍烏賊、曼氏無針烏賊、貽貝、花蛤、三疣梭子蟹、細點圓趾蟹、圓尾鱟等共計13 種樣品進行檢測，其中織紋螺、花蛤、圓尾鱟樣品中檢出TTX，濃度依次為56.4，2.43 和174 μg/kg。分析結果表明，本方法采用免疫親和柱凈化、液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測海洋生物中河豚毒素，靈敏度高，精密度和回收率均能滿足檢測分析的要求。

表2 TTX 的標準加入回收率和相對標準偏差(n=6)Table 2 Recoveries of standard addition and relative standard deviation for TTX (n=6)

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