王瑞國 蘇曉鷗 程芳芳 王培龍 樊霞 張維
(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100081)
霉菌毒素(Mycotoxins)是由某些霉菌在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物[1],飼料原料特別易于被各種霉菌毒素污染[2],從而對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)帶來各種危害。目前,已經(jīng)確認(rèn)化學(xué)結(jié)構(gòu)的霉菌毒素達(dá)400多種[3]。其中,對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)影響較大的主要有黃曲霉毒素、嘔吐毒素、T-2 毒素和玉米赤霉烯酮等數(shù)十種,導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能下降、繁殖力降低、疾病易感性增強(qiáng)和嘔吐、腹瀉、器官壞死等急性和慢性中毒癥狀[4]。世界衛(wèi)生組織將霉菌毒素納入食品安全體系重點(diǎn)監(jiān)測(cè)內(nèi)容[5],我國對(duì)食品和飼料中黃曲霉毒素B1等重要毒素規(guī)定了最高限量標(biāo)準(zhǔn)[6~10]。傳統(tǒng)的霉菌毒素檢測(cè)方法主要有薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)等。這些方法一般只能針對(duì)一種或一類結(jié)構(gòu)類似的毒素進(jìn)行快速篩選、定性或定量檢測(cè)[3]。事實(shí)上,飼料原料中霉菌毒素污染通常是多種霉菌毒素的聯(lián)合污染[11]。因此,開發(fā)多種霉菌毒素同步檢測(cè)方法具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法集高效分離和多組分定性與定量檢測(cè)于一體,成為近年來霉菌毒素多殘留檢測(cè)技術(shù)的主流方向[12]。如趙孔祥等[13]建立了在線免疫親和凈化LC-MS/MS 檢測(cè)中草藥中10 種霉菌毒素的方法,應(yīng)永飛等[14]建立了多功能凈化柱LC-MS/MS 檢測(cè)飼料中14 種霉菌毒素的方法。鄭翠梅等[15]采用LC-TOFMS 同時(shí)測(cè)定糧食中13 種真菌毒素。但是,上述方法需要專用的前處理設(shè)備和成本較高的免疫親和柱,或者需要樣品脫脂,正離子和負(fù)離子分別檢測(cè)等較為繁瑣的步驟,而且同時(shí)檢測(cè)霉菌毒素的數(shù)量仍然比較有限。本研究采用一種商品化的霉菌毒素多功能凈化柱對(duì)樣品進(jìn)行一次凈化和濃縮,不需要脫脂程序,并且通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件,實(shí)現(xiàn)了正、負(fù)離子同時(shí)測(cè)定,做到一次前處理和一次進(jìn)樣同時(shí)檢測(cè)飼料原料中26 種霉菌毒素,具有操作簡(jiǎn)單、快速、成本低、定量準(zhǔn)確的特點(diǎn)。
超高效液相色譜-電噴霧電離源-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters 公司);RVC 2-18 臺(tái)式離心濃縮儀(德國CHRIST 公司);3K15 高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma 公司);D37520 高速離心機(jī)(美國Kendro 公司);Mycospin 400 多功能凈化柱(ROMER 公司);霉菌毒素空白玉米和豆粕樣品由國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(北京)惠贈(zèng)。
標(biāo)準(zhǔn)品及由標(biāo)準(zhǔn)品配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液(溶劑為乙腈)濃度信息見表1。乙腈、甲醇、乙酸銨和甲酸(色譜純,美國Fisher 公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水?;旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液于-20 ℃保存,使用時(shí)分別吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,經(jīng)離心濃縮儀旋干后,用水-甲醇-甲酸(95∶4.9∶0.1,V/V)溶液溶解,配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。
稱取5.00 g ± 0.01 g 試樣于50 mL 塑料離心管中,加入20 mL 乙腈-水-甲酸(84∶15.9∶0.1,V/V)進(jìn)行提取,渦旋混勻1 min,超聲提取1 h,期間每20 min 振蕩1 次。提取完成后,以10000 r/min 離心10 min,取1 mL 上清液于Mycospin 400 多功能凈化柱中,渦旋2 min 使溶液與凈化材料充分混合,打開凈化柱底部出液口,置于配套收集管中,5000 r/min 離心1 min,收集濾液。將濾液置于離心濃縮儀中,60 ℃,1500 r/min 真空旋干。用0.25 mL 水-甲醇-甲酸(95∶4.9∶0.1,V/V)溶解殘?jiān)?,渦旋1 min,超聲5 min,13000 r/min 離心10 min,移取上清液于進(jìn)樣瓶中待測(cè)。
Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm ×2.1 mm,1.7 μm,美國Waters 公司);柱溫40 ℃,流速0.42 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相A 為0.1%甲酸-水,流動(dòng)相B 為0.1%甲酸-甲醇。梯度洗脫:0 ~2.0 min,95% A;2.0 ~4.0 min,95% ~90% A;4.0 ~12.0 min,90% ~25% A;12.0 ~12.1 min,25% ~1% A;12.1 ~14.0 min,1% A;14.0 ~14.1 min,1% ~95% A;14.1 ~16 min,95% A。
表1 霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品列表Table 1 Standard compounds of 26 mycotoxins
電噴霧離子源(ESI),離子源溫度為150 ℃,脫溶劑溫度為450 ℃,脫溶劑氣和錐孔氣均為N2,脫溶劑氣流速為900 L/h,錐孔氣流速為20 L/h。序號(hào)1 ~20 霉菌毒素采用正離子(ESI+)監(jiān)測(cè),序號(hào)21 ~26霉菌毒素采用負(fù)離子(ESI-)監(jiān)測(cè)方式,毛細(xì)管電壓為0.75 kV。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式檢測(cè),監(jiān)測(cè)離子、碰撞能量、錐孔電壓等參數(shù)見表2。
3.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 以甲醇-水(50∶50,V/V)為流動(dòng)相,采用結(jié)合(Combine)進(jìn)樣方式,對(duì)26 種霉菌毒素的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化,在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描,選擇合適的準(zhǔn)分子離子峰和電離方式。根據(jù)化合物的響應(yīng),設(shè)置不同的掃描模式。其中,正電離模式下獲得[M +H]+、[M +NH4]+或[M +Na]+,負(fù)電離模式下獲得[M-H]-。結(jié)合基質(zhì)空白和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的離子掃描圖,進(jìn)一步優(yōu)化參數(shù),確定了各種毒素在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下信號(hào)采集的特征離子對(duì)及質(zhì)譜條件(表2)。
表2 MRM 監(jiān)測(cè)模式下26 種霉菌毒素的質(zhì)譜優(yōu)化條件Table 2 Optimized MS/MS parameters of 26 mycotoxins
3.1.2 色譜條件優(yōu)化 考察了0.1%甲酸-水/0.1%甲酸-甲醇(A)、0.1%甲酸-水/0.1%甲酸-乙腈(B)、0.2 mmol/L 乙酸銨溶液/甲醇(C)、0.2 mmol/L 乙酸銨溶液/乙腈(D)等4 種流動(dòng)相體系對(duì)26 種霉菌毒素的分離效果和峰信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果表明,26 種毒素在A 和B 流動(dòng)相體系能夠全部出峰,并且超過半數(shù)的霉菌毒素峰信號(hào)在A 體系中明顯高于B 體系,如3-AcDON、15-AcDON、HT-2、T-2、VER 等毒素在A 體系中峰信號(hào)響應(yīng)值超過B 體系下5 ~10 倍;NIV,BrERG 等在C 和D 流動(dòng)相體系中不出峰或有較長(zhǎng)拖尾。因此,本研究選擇A 流動(dòng)相體系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),洗脫梯度的設(shè)定對(duì)目標(biāo)物峰信號(hào)強(qiáng)度有很大影響,如OTA 和OTB 保留時(shí)間越往后,其峰面積響應(yīng)值成倍增加,可能與雜質(zhì)分離度或電離時(shí)的溶劑比例有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)梯度洗脫條件下,分段采集目標(biāo)物峰信號(hào),16 min 完成26 種霉菌毒素分離與檢測(cè)。圖1 為空白玉米加標(biāo)的定量離子色譜圖。
3.2.1 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià) 用水-甲醇-甲酸(95∶4.9∶0.1,V/V)配制系列梯度濃度(目標(biāo)物序號(hào)3,4,5,6,7,10,11,12,13,17,19,20 為2,5,10,25和100 ng/mL;目標(biāo)物序號(hào)1,2,8,9,14,15,16,18,21,22,23,24,25,26 為10,25,50,125 和500 ng/mL)混合標(biāo)樣,同時(shí)稱取玉米和豆粕樣品,按照前處理步驟進(jìn)行提取、凈化和分析,并對(duì)空白樣品進(jìn)行分析,確定不含痕量目標(biāo)物后,再用空白樣品進(jìn)樣液稀釋與溶劑標(biāo)樣濃度相同的系列基質(zhì)匹配標(biāo)樣,分別以標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。溶劑標(biāo)樣和基質(zhì)匹配標(biāo)樣的斜率和相關(guān)系數(shù)(R2)列于表3。溶劑和基質(zhì)匹配標(biāo)樣曲線線性良好,R2均大于0.99?;|(zhì)匹配與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值可反映出基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱。在本實(shí)驗(yàn)中,玉米和豆粕基質(zhì)對(duì)此26 種霉菌毒素均產(chǎn)生了不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)。
圖1 空白玉米基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量離子色譜圖(3,4,5,6,7,10,11,12,13,17,19,20 濃度為20 μg/kg,其它為100 μg/kg)Fig.1 Chromatograms of quantification transitions of blank maize matrix-matched standard (20 μg/kg for 3,4,5,6,7,10,11,12,13,17,19,20;100 μg/kg for others)
表3 溶劑和基質(zhì)匹配 標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和R2Table 3 Slope and R2of solvent and matrix-matched calibration curves
3.2.2 方法的線性范圍與定量限 分別向玉米和豆粕空白樣品提取液中添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照2.2 節(jié)所述,取1 mL 經(jīng)Mycospin400 凈化,真空旋干,用0.25 mL 水-甲醇-甲酸(95∶4.9∶0.1,V/V)溶解,配制濃度為1 ~100 μg/kg(目標(biāo)物序號(hào)為:3,4,5,6,7,10,11,12,13,17,19,20,21)和5 ~500 μg/kg(目標(biāo)物序號(hào)為:1,2,8,9,14,15,16,18,22,23,24,25,26)的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)10 倍信噪比(S/N)確定化合物的方法定量限(LOQ),以濃度為橫坐標(biāo),定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸計(jì)算,所得R2均大于0.99,結(jié)果見表4。
表4 玉米和豆粕基質(zhì)中26 種霉菌毒素的定量限,線性范圍,平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等方法性能參數(shù)Table 4 Performance parameters of method such as LOQ,linear range,average recoveries and RSD of 26 target mycotoxins in maize and soybean meal
3.2.3 回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 采用玉米和豆粕空白樣品,進(jìn)行添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)。樣品中添加低、中、高3 個(gè)濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)添加濃度設(shè)6 個(gè)平行,按本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理和上機(jī)測(cè)定,平均回收率為61.9% ~119.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.8% ~18.6%,結(jié)果見表4。
應(yīng)用本方法對(duì)2013 年采自東北和華北地區(qū)的76 個(gè)玉米和84 個(gè)豆粕樣品中26 種霉菌毒素進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[7~10]規(guī)定了最高限量的4 種霉菌毒素,AFB1,T-2,DON 和ZEN 在玉米樣品中檢出率分別為7.9%,0%,76.3%和39.5%,在豆粕樣品中的檢出率分別為4.8%,0%,66.7%和38.1%。其中,AFB1和ZEN 在玉米、豆粕樣品中的超標(biāo)率均為0。由于飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)沒有對(duì)玉米和豆粕中DON 作出限量規(guī)定,參考配合飼料中DON 最高限量1000 μg/kg,則13.1%的玉米樣品和2.4%的豆粕樣品中DON 含量超過1000 μg/kg。其它尚沒有限量標(biāo)準(zhǔn)的霉菌毒素除ERG 未檢出外,其它毒素均有不同程度的檢出。
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