劉明鈺 李敏 陳娟娟 郭嫻 嚴(yán)小軍

(寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波315211 )

1 引言

自由基能夠引起脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA 氧化損壞等重要分子物質(zhì)損傷［1，2］，同時(shí)還會(huì)引起慢性?。?，4］，因此，尋找有效的抗氧化劑對(duì)人體健康具有非常重要的作用。亞麻籽含有大量的α－亞麻酸和亞麻木酚素，是其它植物含量的600 ～700 倍［5］，在食品領(lǐng)域和疾病治療方面具有重要應(yīng)用［6，7］。木酚素和雙酚化合物耦合物生成了兩種松柏醇，形成一個(gè)抗氧化防御系統(tǒng)［8］，開(kāi)環(huán)異落松樹(shù)脂酚二葡萄糖苷(Secoisolariciresinol Diglucoside，SDG)、開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚(Secoisolariciresinol，SECO)作用生成二糖苷SDG 是典型的木酚素類［9，10］。大量研究表明，亞麻籽中的SDG 和SECO，哺乳動(dòng)物中的腸二醇(Enterodiol，ED)和腸內(nèi)酯(Enterolactone，EL)具有抗氧化活性，SDG 由人類結(jié)腸微生物群落水解代謝產(chǎn)生ED，ED 進(jìn)一步被氧化產(chǎn)生EL［11］。因此，亞麻籽中抗氧化成分的快速篩選具有重要意義。

通過(guò)體內(nèi)抗氧化活性檢測(cè)，能夠更準(zhǔn)確地反應(yīng)出抗氧化劑作用于生物體的真實(shí)抗氧化性能，但同時(shí)體內(nèi)抗氧化活性檢測(cè)受干擾因素也極其多，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響非常大，這樣導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)性降低。而傳統(tǒng)的體外抗氧化測(cè)定方法要求化合物純度高、價(jià)格昂貴，檢測(cè)方法費(fèi)力、耗時(shí)。本方法采用高效液相色譜法在線分離和評(píng)價(jià)抗氧化活性，具有穩(wěn)定性好、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)［12，13］?？寡趸瘎┡c2，2－二苯基－1－苦肼基(2，2－diphenyl－1－picrylhydrazyl，DPPH)自由基混合后，其活性或抗氧化能力衰減［14，15］，高效液相色譜方法將抗氧化劑與DPPH 自由基分離，根據(jù)反應(yīng)前后抗氧化劑峰面積變化量計(jì)算抗氧化劑的抗氧化活性。因此，抗氧化能力衰減是一種快速、可靠地測(cè)量自由基清除活性的方法，尤其是在復(fù)雜混合物中。

本研究以SDG、SECO 和ED 為研究對(duì)象，建立了抗氧化物質(zhì)活性篩選的DPPH－HPLC法。利用超高效液相色譜－飛行時(shí)間質(zhì)譜(Ultra performance liquid chromatography coupled with quadruple time－of－flight mass spectrometry，UPLC－Q－TOF－MS)鑒定亞麻籽提取物中化合物成分。利用本方法對(duì)亞麻籽提取物的活性物質(zhì)進(jìn)行了抗氧化活性能力比較。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Waters 2695 液相色譜儀、Waters 2998PDA 紫外檢測(cè)器，Waters Q－TOF premier 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters 公司);酶標(biāo)儀(日本Thermo 公司);超聲儀(寧波新芝生物科技有限公司)。

脫脂水解過(guò)的亞麻籽提取物(長(zhǎng)沙捷凱生物制品有限公司);SDG，SECO 和ED(上海田同公司);DPPH(美國(guó)Sigma－Aldrich 公司);甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck 公司);純水由超純水系統(tǒng)制備。

2.2 儀器工作條件

2.2.1 色譜條件 C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃;流動(dòng)相:乙腈(A)，水(B);梯度洗脫:0 ～5 min，10% ～15% A;5 ～15 min，15% ～25% A;15 ～45 min，25% A;45 ～50 min，25% ～70% A;50 ～55 min，70% A;55 ～60 min，70% ～90% A。流速0.6 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

2.2.2 超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜條件 亞麻籽活性成分分析采用Waters ACQUITY 超高效液相色譜系統(tǒng)(UPLC)，使用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm ×2.1 mm，1.7 μm)作為固定相。流動(dòng)相為:乙腈(A)－水(B);梯度洗脫:0 ～5 min，10% ～15% A;5 ～15 min，15% ～25% A;15 ～45 min，25% A;45 ～50min，25% ～70% A;50 ～55 min，70% A;55 ～60 min，70% ～90% A;流速0.6 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL。柱后1∶4 分流進(jìn)入質(zhì)譜。高分辨質(zhì)譜儀采用Waters Q－TOF premier 質(zhì)譜儀。質(zhì)譜儀條件:離子源為ESI，質(zhì)量分析器為四極桿飛行時(shí)間，正離子檢測(cè)模式，離子源溫度150℃，脫溶劑溫度300 ℃，脫溶劑氮?dú)饬魉?00 L/h，錐孔反吹氮?dú)?，毛?xì)管電離電壓3.0 kV，取樣錐孔電壓為80 V，四極桿掃描范圍為m/z 50 ～1200。根據(jù)不同的物質(zhì)，全程掃描(Full scan)質(zhì)譜碰撞能量在25 ～35 eV。使用亮腦啡肽(m/z 556.2771，［M+H］+)作為外標(biāo)物，對(duì)目標(biāo)離子進(jìn)行精確質(zhì)量分析。

2.3 樣品前處理

取亞麻籽粉末100 mg，加入2 mL 甲醇溶液，常溫下超聲60 min，過(guò)濾除殘?jiān)?，將上清液蒸干，以甲醇溶解，置?4 ℃保存待用。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

分別稱取SDG，SECO 和ED 3 種標(biāo)準(zhǔn)品各0.2 mg，加入乙腈－水(1∶ 1，V/V)溶液1 mL，配成0.2 g/L 儲(chǔ)備溶液，再分別稀釋成10，25，50，100 和200 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.5 抗氧化能力測(cè)定

2.5.1 DPPH-HPLC法 按樣品與DPPH 體積比1∶1 進(jìn)行混合、反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為30 min，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為200 ～600 nm。按2.2.1 節(jié)色譜條件，每個(gè)樣品測(cè)3 個(gè)平行取平均值?？寡趸瘎┣宄?Scavenging ratio of the antioxidant，SRA)作為衡量DPPH 自由基清除活性的指標(biāo)，其計(jì)算公式如下:

其中，Sblank是指與DPPH 自由基反應(yīng)前抗氧化劑的含量;Ssample是指與DPPH 自由基反應(yīng)后抗氧化劑的含量。SRA 值代表抗氧化劑在與DPPH 自由基反應(yīng)過(guò)程中的減少率。

2.5.2 酶標(biāo)儀法準(zhǔn)確稱取0.2 mg 的SDG，SECO，ED 和DPPH，各溶于無(wú)水乙醇，配成濃度為0.2 g/L的儲(chǔ)備溶液，于-4 ℃保存待用。各取50 μL 溶液置于96 孔板中，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)定在517 nm，37 ℃孵化30 min 后，測(cè)定各溶液吸光度值，每個(gè)樣品平行測(cè)3 次取平均值［16］。自由基清除率(Scavenging ratio，SR)計(jì)算公式如下:

其中，Asample為DPPH 自由基與抗氧化劑反應(yīng)30 min 后溶液吸光度，Acontrol為DPPH 溶液吸光度。

3 結(jié)果與討論

3.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)抗氧化能力的影響

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作液在高效液相色譜儀上進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)。3 種標(biāo)準(zhǔn)品SDG，SECO 和ED 在10 ～200 mg/L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，分別以信噪比(S/N)為3 和10 的標(biāo)準(zhǔn)樣品量為檢出限和定量限，可算出SECO，SDG 和ED 的檢出限為5.4 ～7.7 mg/L，定量限為18 ～26 mg/L。經(jīng)過(guò)連續(xù)3 天重復(fù)測(cè)定，得出日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0%，說(shuō)明高效液相色譜測(cè)定抗氧化劑的抗氧化活性方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可行性高。

表1 SDG，SECO 和ED 的線性方程，檢出限和定量限Table 1 Linearity，LOD and LOQ of SDG，SECO and ED

此外，考察了自由基清除活性與反應(yīng)時(shí)間之間的關(guān)系。將3 種標(biāo)準(zhǔn)品SDG，SECO 和ED 分別與DPPH 反應(yīng)10，20，30，40，50 和60 min，平行3 次，計(jì)算其SRA 值(圖1)。結(jié)果表明，抗氧化劑與DPPH自由基的反應(yīng)在很短時(shí)間內(nèi)就可以達(dá)到平衡，且SRA 值在不同反應(yīng)時(shí)間下的變化較小，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于7.9%，可以忽略時(shí)間對(duì)SRA 值的影響，使得本實(shí)驗(yàn)更加可靠和便利。

3.2 DPPH-HPLC法在單一標(biāo)準(zhǔn)品中的應(yīng)用

分別將0.1 mL 濃度為0.2 g/L 的3 種標(biāo)準(zhǔn)品溶液(SECO、SDG、ED)與0.1 mL 0.2 g/L DPPH 自由基混合反應(yīng)20 min，經(jīng)液相色譜分析，計(jì)算出濃度為Ssample。分別將0.1 g/L 的3 種標(biāo)準(zhǔn)品(SECO，SDG和ED)溶液直接進(jìn)行液相色譜分析，計(jì)算出濃度為Sblank。通過(guò)上述SRA 計(jì)算公式，得到3 種標(biāo)準(zhǔn)品的自由基清除率(表2)。根據(jù)SRA 值可見(jiàn)，自由基清除活性順序?yàn)?SDG ＞SECO ＞ED。3 種標(biāo)準(zhǔn)品和DPPH 反應(yīng)前后液相色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 抗氧化劑SDG，SECO 和ED 自由基清除率對(duì)時(shí)間關(guān)系圖Fig.1 Free radical scavenging rate variation of SDG，SECO and ED over time

表2 單一標(biāo)準(zhǔn)品和混合標(biāo)準(zhǔn)品的自由基清除率Table 2 Seavenging ratio of the antioxidant (SRA)of SDG，ED and SECO by 2，2－diphenyl－1－picrylhydrazyl (DPPH)－HPLC assay and microplate reader assay

采用傳統(tǒng)的酶標(biāo)儀測(cè)試SECO，SDG 和ED 對(duì)DPPH 的自由基清除率(SR，按公式(2)計(jì)算)。由表2可知，DPPH 自由基清除能力順序?yàn)镾DG ＞SECO ＞ED。該結(jié)果表明，采用酶標(biāo)儀法結(jié)合DPPH 自由基的消失量計(jì)算的抗氧化劑清除自由基能力，與采用HPLC 方法結(jié)合抗氧化劑的消失量計(jì)算抗氧化劑清除自由基能力一致，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了DPPH－HPLC法測(cè)試抗氧化劑清除自由基能力的可靠性和準(zhǔn)確性。

3.3 DPPH-HPLC法在混合標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用

將標(biāo)準(zhǔn)品SECO，SDG 和ED 兩兩混合，或3 種混合后，再與DPPH 反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表2，可知在兩兩混合或者三者混合標(biāo)準(zhǔn)品中，SECO，SDG 和ED 的DPPH 自由基清除能力均比單一標(biāo)準(zhǔn)品情況減弱，但仍可以發(fā)現(xiàn)DPPH 自由基清除率為SDG ＞SECO ＞ED，與單一標(biāo)準(zhǔn)品清除自由基的活性順序一致。因此本方法可用于對(duì)天然產(chǎn)物的復(fù)雜提取物進(jìn)行活性篩選。

3.4 DPPH-HPLC法在亞麻籽復(fù)雜提取物中的應(yīng)用

圖2 (A)為SECO，SDG 和ED 混合標(biāo)準(zhǔn)品與DPPH 自由基反應(yīng)前后的液相色譜圖;(B)為亞麻籽提取物與DPPH 自由基反應(yīng)前后的液相色譜圖Fig.2 (A)Liquid chromatogram before and after the reaction of DPPH and the mixture of SECO，SDG and ED;(B)Liquid chromatogram before and after the reaction of flax extractive and DPPH

將本方法應(yīng)用于復(fù)雜提取物中抗氧化劑快速篩選，亞麻籽提取物在280 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，亞麻籽提取物中5 種主要抗氧化成分參與DPPH 自由基清除(圖2B)。根據(jù)高分辨質(zhì)譜信息，對(duì)5 種亞麻籽抗氧化劑的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，結(jié)構(gòu)信息如圖3 所示?；衔? 和5 在質(zhì)譜的正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 704.3100，在高能量模式下獲得相同的碎片離子m/z 363.2797，345.1663，327.1570，295.1361，221.1186 和163.0747，因此可以判斷化合物4 和5 為一對(duì)異構(gòu)體，并且與標(biāo)準(zhǔn)品SDG 的準(zhǔn)分子離子峰和碎片離子峰一致。再利用液相色譜的保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，因此判斷化合物4 為SDG，化合物5 為SDG 異構(gòu)體?；衔? 在正離子模式下得到［M + Na］+m/z 575.2081，在高能量模式下，得到碎片離子m/z 413.1533，為母離子中性丟失162 Da，即葡萄糖苷。繼續(xù)丟失48 Da，即CH2O+H2O碎片產(chǎn)生碎片離子m/z 365.1385。碎片離子m/z 219可推測(cè)為2－甲氧基苯酚。結(jié)合上述碎片離子和文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果，該化合物可鑒定為(7α-［(β－D－glupyranosyl］oxy)－1－methoxyisola－riciresinol)。化合物2 的［M+Na］+離子為m/z 413.1558，在高能量模式下得到碎片離子m/z 269.1390和167.0713，可以說(shuō)明有2，4－二甲氧基苯酚基團(tuán)存在。碎片離子m/z 139.0567 和123.0432 表明結(jié)構(gòu)中含有2－甲氧基苯酚基團(tuán)。且整個(gè)碎片中未找到丟失糖基的相關(guān)碎片，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，化合物2 可推測(cè)為(6R，7R，8S)－1－Methoxyisolariciresinol?；衔? 的準(zhǔn)分子離子峰為［M+Na］+m/z 649.1358。母離子連續(xù)丟失兩分子的葡萄糖苷生成碎片離子m/z 487.0864 和325.0331。其分子量和碎片離子符合蜀葵苷元二葡萄糖苷(Herbacetindiglucoside)的結(jié)構(gòu)特性，并且已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了在亞麻籽中存在該化合物，因此推測(cè)化合物3為蜀葵苷元二葡萄糖苷。

這5 種抗氧化劑表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力。由表3 可知，自由基清除能力為SDG 異構(gòu)體(5)＞SDG (4)＞7α-［(β－D－glupyranosyl)oxy］－1－methoxyisolariciresinol (1)＞(6R，7R，8S)－1－Methoxyisolariciresinol (2)＞蜀葵苷元二葡萄糖苷(3)。結(jié)合這5 種抗氧化劑，標(biāo)準(zhǔn)品SDG，SECO 和ED 的SRA 數(shù)據(jù)及其結(jié)構(gòu)信息可知，除了化合物3 為黃酮類物質(zhì)，其余均為木酚素。比較化合物1，2，4 和5發(fā)現(xiàn)，它們具有非常類似的結(jié)構(gòu)，化合物1 和2 含有六元環(huán)，而化合物4 和5 不存在六元環(huán)，結(jié)果表明，不存在六元環(huán)的化合物4 和5 具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力，而化合物1 和2 的DPPH 自由基清除能力較差。比較SDG 和SECO，以及化合物1 和2 可知，相似結(jié)構(gòu)中，含有葡萄糖苷化合物具有較強(qiáng)的自由基清除能力，即SRA 值:SDG ＞SECO，化合物1 ＞化合物2。根據(jù)上述數(shù)據(jù)可知，構(gòu)效關(guān)系在活性篩選中起到了重要作用。

圖3 SDG、SECO、ED 以及5 種亞麻籽抗氧化劑的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of SDG，SECO，ED and five antioxidants of flax seed

表3 亞麻籽提取物的DPPH 自由基清除率Table 3 The scavenging ratio of antioxidant (SRA)values of five lignans from flax seed extracts

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用HPLC－DPPH 方法分離篩選出亞麻籽提取物中5 種抗氧化成分，同時(shí)對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行分析。本方法簡(jiǎn)便、快速、分離度高、穩(wěn)定性好，可以對(duì)復(fù)雜混合物直接進(jìn)行分析，不用對(duì)混合物進(jìn)行分離純化，節(jié)省了分析時(shí)間，適用于粗提物中抗氧化成分的快速分析。

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