潘海英，王紅靜，徐 盼，楊凌云，賈西彪，陳 靜，陳 岑

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，四川 成都 610041)

在位子宮內(nèi)膜神經(jīng)生長(zhǎng)因子在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及其臨床意義

潘海英，王紅靜，徐 盼，楊凌云，賈西彪，陳 靜，陳 岑

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，四川 成都 610041)

目的 探討在位子宮內(nèi)膜神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)在子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)中的表達(dá)及其臨床意義。方法 選擇2013年9 月至2014年3月在四川大學(xué)華西第二醫(yī)院行手術(shù)治療的EMS患者39例(A組)，其中疼痛22例(A1組)，無(wú)疼痛17例(A2組)。選擇同期因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)III行子宮切除的24例患者作為對(duì)照(B組)。采用免疫組化法檢測(cè)各組子宮在位內(nèi)膜中NGF的表達(dá)。結(jié)果 NGF在A組及B組在位子宮內(nèi)膜上均有陽(yáng)性表達(dá)，但A組、A1組NGF的表達(dá)均明顯高于B組(P< 0.05)，A1組表達(dá)明顯高于A2組(P< 0.05)，而A2與B組比較表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。結(jié)論 EMS患者在位子宮內(nèi)膜 NGF表達(dá)增加，伴有疼痛者更明顯。NGF可能參與了EMS疼痛的發(fā)生。

子宮內(nèi)膜異位癥；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；疼痛

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥，是子宮外含有子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)的雌激素依賴性病變，始于細(xì)胞水平而止于盆腔疼痛和不孕[1]。80%的EMS患者有慢性盆腔痛(chronic pelvic pain，CPP)，主要表現(xiàn)為經(jīng)期或經(jīng)前后出現(xiàn)的腹痛、腰骶部疼痛，甚至劇痛難忍，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和身心健康。EMS的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究顯示EMS疼痛與在位內(nèi)膜神經(jīng)纖維密度有關(guān)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophin，NT)在誘導(dǎo)及維持神經(jīng)纖維生長(zhǎng)中起著重要的作用，而其中的在位子宮內(nèi)膜神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是產(chǎn)生疼痛及痛覺(jué)過(guò)敏的關(guān)鍵因素[2]，由此推測(cè)NGF可能與EMS患者的疼痛有關(guān)。本研究擬通過(guò)免疫組化法檢測(cè)NGF在EMS在位內(nèi)膜的表達(dá)，了解其在EMS疼痛發(fā)生中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年9月至2014年3月在四川大學(xué)華西第二醫(yī)院經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為EMS且同意術(shù)中同時(shí)行診刮術(shù)的39例患者(A組)，其中疼痛22例(A1組)和無(wú)疼痛17例(A2組)，A1組年齡22～49歲[(34.3±4.1)歲]，A2組年齡24～47歲[(35.7±6.3歲))。選擇同期因CINIII行子宮切除的24例患者作為對(duì)照(B組)，年齡20～45歲[(31.3±5.1歲)]。A組排除子宮腺肌癥和術(shù)前3月內(nèi)接受過(guò)激素治療的患者，B組排除EMS、子宮腺肌癥和術(shù)前3月內(nèi)接受過(guò)激素治療的患者。A1、A2和B組在孕產(chǎn)次、年齡、月經(jīng)周期等方面比較成差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，A1組和A2組在手術(shù)分期分布上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。

1.2 方法 分別提取病例組在位內(nèi)膜組織和對(duì)照組在位內(nèi)膜組織的石蠟切片，制成4 μm厚切片。采用免疫組化辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-二甲基聯(lián)苯胺(DAB)檢測(cè)顯示系統(tǒng)分析A，B兩組中NGF的表達(dá)情況。試劑一抗多克隆兔抗人NGF抗體(工作濃度1∶100)購(gòu)自北京希美杰生物技術(shù)有限公司。免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。用小鼠腦組織作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。用倒置生物顯微鏡觀察切片，并對(duì)圖像進(jìn)行采集。

1.3 結(jié)果判定 參照Shimizu等[3]的免疫組化評(píng)分方法，進(jìn)行半定量評(píng)分。顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(×200)，綜合細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分，5%～為1分，25%～為2分，50%～為3分，≥75%為4分。每張切片讀取5個(gè)視野的平均值，將細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分和陽(yáng)性細(xì)胞比例計(jì)分相加，作為最后積分。根據(jù)最后積分，≤1分為陰性(-)，>1分且≤3分為弱陽(yáng)性(+)，>3分且≤5分為陽(yáng)性(++)，>5分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。EMS手術(shù)分期參照美國(guó)生育協(xié)會(huì)提出的“修正子宮內(nèi)膜異位癥分期法(1997年)”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

NGF在A組及B組在位子宮內(nèi)膜上均有不同程度表達(dá)。陽(yáng)性顆粒主要定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞漿和胞膜。A組、A1組、A2組和B組NGF表達(dá)陽(yáng)性率分別為76.9%、95.5%、52.9%和45.8%，其中A組、A1組均明顯高于B組(P< 0.05)，A1組明顯高于A2組(P< 0.05)。A2與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，見(jiàn)表1及圖1。

表1 不同分組NGF的表達(dá)

#A組與B組比較；## A1組與B組比較；### A1組與A2組比較；#### A2組與B組比較

3 討論

EMS病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前推測(cè)神經(jīng)機(jī)制可能在其發(fā)病中起著重要作用[4]。有研究顯示內(nèi)異癥是一種混合炎癥、神經(jīng)性疼痛的病癥[5]。Stratton 等[6]通過(guò)電子數(shù)據(jù)庫(kù)檢索1967年后報(bào)道的疼痛婦女的臨床基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)：內(nèi)膜異位病灶可以誘發(fā)自己的神經(jīng)支配，從而產(chǎn)生病變與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的直接和雙向互動(dòng)聯(lián)系。

圖1 NGF在子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況(DAB×200) a：NGF陰性表達(dá)；b：NGF弱陽(yáng)性表達(dá)；c：NGF陽(yáng)性表達(dá)；d：NGF強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)

NT是一類由神經(jīng)所支配的組織(如肌肉)和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的且為神經(jīng)元生長(zhǎng)與存活所必需的蛋白質(zhì)分子，對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育、存活和凋亡起重要作用。其中NGF是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)因子，在神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)、維持中起著重要作用。正常人的子宮肌層、子宮內(nèi)膜與子宮肌層交界面及子宮內(nèi)膜基底層的深部都有神經(jīng)纖維支配，但子宮內(nèi)膜的上2/3無(wú)神經(jīng)纖維[7]。

EMS患者病灶內(nèi)的高神經(jīng)纖維分布與其神經(jīng)因子高表達(dá)相伴出現(xiàn)。McKinnon 等[8]檢測(cè)了EMS患者異位組織神經(jīng)纖維及腹腔液神經(jīng)因子濃度，結(jié)果顯示與EMS相關(guān)的疼痛和腹腔液神經(jīng)因子的濃度有關(guān)。Barcena[9]進(jìn)行神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的前瞻性臨床研究，比較了EMS、子宮腺肌病、盆腔粘連患者腹腔液中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(Neurotrophin-3，NT-3)的濃度，發(fā)現(xiàn)內(nèi)異癥患者腹腔液中NGF、BDNF的濃度明顯升高。Kajitani等[10]通過(guò)測(cè)定EMS患者與非EMS患者腹腔液中NGF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EMS患者腹腔液中的NGF表達(dá)水平顯著高于常人水平。

我們研究了NGF因子在EMS與非EMS患者在位子宮內(nèi)膜上的表達(dá)，結(jié)果顯示：NGF在EMS患者在位內(nèi)膜的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中又尤以在EMS疼痛患者在位內(nèi)膜中的表達(dá)最高，高達(dá)95.5%，其明顯高于非疼痛組及對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。非疼痛組與對(duì)照組相比，NGF表達(dá)略高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示NGF主要通過(guò)參與EMS的疼痛而參與EMS的發(fā)生。

NGF參與EMS疼痛發(fā)生的神經(jīng)機(jī)制可能與下列因素有關(guān)：NGF及其受體增加能促進(jìn)感覺(jué)神經(jīng)纖維的增生。Arnold[11]報(bào)道內(nèi)異癥腹膜病灶中交感神經(jīng)纖維密度降低而感覺(jué)神經(jīng)纖維密度增加。Bokor等[12]研究顯示：小神經(jīng)纖維的密度在輕度子宮內(nèi)膜異位患者的子宮內(nèi)膜中與正常盆腔的患者相比高出14倍。NGF本身亦是一種疼痛介質(zhì)，能誘導(dǎo)與調(diào)控與中樞疼痛傳導(dǎo)有關(guān)的P物質(zhì)(Substance P，SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)及神經(jīng)絲(neurofilament，NF)的表達(dá)。腎上腺能神經(jīng)末梢釋放前列腺素E2，前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)，這些物質(zhì)能使感覺(jué)神經(jīng)C致敏[13]。作為重要的前列腺素合成限速酶的環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，Cox-2)能增加侵襲性、誘導(dǎo)血管形成，在內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜，其表達(dá)亦明顯增高，使之有助于內(nèi)膜細(xì)胞的粘附侵襲。這也符合我國(guó)學(xué)者提出的“在位內(nèi)膜決定論”。而EMS患者病灶中的神經(jīng)纖維可能即來(lái)源于在位內(nèi)膜功能層的神經(jīng)纖維，或是有活性的在位內(nèi)膜脫落后，種植在腹腔等其他部位時(shí)所分泌的能促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的細(xì)胞因子如NGF。EMS腺體和血管附近有神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體p75(NGFRp75)陽(yáng)性的神經(jīng)纖維表達(dá)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子通過(guò)EMS腺體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[14]。這提示腹膜子宮內(nèi)膜異位病灶可能受感覺(jué)神經(jīng)A、感覺(jué)神經(jīng)C、膽堿能和腎上腺素能神經(jīng)纖維支配。Barcena de Arellano等[15]比較EMS患者與其他婦科患者的腹腔液神經(jīng)元生長(zhǎng)的體外模型和NGF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EMS和子宮內(nèi)膜異位病灶的腹腔液具有親神經(jīng)性。EMS是激素依耐性疾病，雌二醇和孕激素均能刺激NGF在間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，而使用孕激素后，NGF受體則明顯減弱[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)在EMS在位內(nèi)膜中有NGF表達(dá)，且疼痛患者中表達(dá)更顯著，提示NGF可能參與了EMS疼痛的發(fā)生。由此說(shuō)明采用在位內(nèi)膜免疫組化標(biāo)記NGF作為具有疼痛的EMS患者的篩查以及采用神經(jīng)因子拮抗阻斷治療EMS疼痛患者將是可行的。

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The expression of nerve growth factor and its significance in eutopic endometrium of patients with endometriosis

PAN Hai-ying，WANG Hong-jing，XU Pan，YANG Ling-yun，JIA Xi-biao，CHEN Jing，CHEN Cen

(West China Second Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China)

WANGHong-jing

Objective To investigate the expression of nerve growth factor(NGF)in eutopic endometrium of patients with endometriosis，and to explore the role of NGF in the development of endometriosis-associated pain.Methods A total of 63 patients underwent surgical were studied.Of these patients，39 underwent surgical endometriosis lesion excision(group A)in which 22 patients suffered from dysmenorrheal(group A1)and 17 patients had no dysmenorrheal(group A2).At the same time，24 patients undergone uterectomy because of cervical intraepithelial neoplasia(CIN)were used as control group(group B).Immunohistochemistry was performed to detect the expression of NGF in eutopic endometrium.Results The level of NGF of endometrium in the group A and the group A1 were significantly higher than that in the group B(P< 0.05).The level of NGF in endometrium in the group A1 was significantly higher than that in the group A2(P< 0.05).There was no statistically significant difference in NGF expression between the group A2 and group B(P> 0.05).Conclusion NGF express in endometrium of patients with dysmenorrhea may participate in the pathogenesis of endometriosis and endometriosis associated pain.

Endometriosis；Nerve growth factor；Dysmenorrhea

四川省科技廳科技支撐基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：2012 SZ0022)

王紅靜

R711.71

A

1672-6170(2015)05-0111-03

2015-01-30；

2015-05-27)