賴杰仁

（九江市中醫(yī)醫(yī)院，江西 九江 332000）

HPLC測(cè)定補(bǔ)腎壯骨膏中補(bǔ)骨脂素的含量

賴杰仁

（九江市中醫(yī)醫(yī)院，江西 九江 332000）

目的：建立補(bǔ)腎壯骨膏中補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜法，Pront osi l 120-5-C18色譜柱（250 m m×4.6 m m，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）；流速1.0 m L/m i n；檢測(cè)波長(zhǎng)246 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果：補(bǔ)骨脂素對(duì)照品進(jìn)樣量在0.009 94～0.496 70 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），補(bǔ)骨脂素平均加樣回收率為98.20%，RSD為1.58%（n=6）。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。適宜用于測(cè)定補(bǔ)腎壯骨膏中補(bǔ)骨脂素的含量。

補(bǔ)腎壯骨膏；補(bǔ)骨脂素；含量測(cè)定；高效液相色譜法

補(bǔ)腎壯骨膏系九江市中醫(yī)醫(yī)院自主研發(fā)的國(guó)家重點(diǎn)?？乒遣】铺厣t(yī)院制劑，本品由補(bǔ)骨脂、杜仲、川續(xù)斷、枸杞子、肉桂等十余味中藥組成，具有補(bǔ)腎壯骨、強(qiáng)筋益精、固本歸元的功效，臨床應(yīng)用于肝腎兩虛、氣滯血瘀的老年性關(guān)節(jié)病，骨質(zhì)疏松，腰腿痛，肢體麻木，耳鳴耳聾。十余年的臨床實(shí)踐表明，本品安全可靠，療效顯著。基于補(bǔ)骨脂素在該復(fù)方制劑中作為主要的指標(biāo)性成分，本文采用高效液相色譜法測(cè)定本品補(bǔ)骨脂素的含量，將補(bǔ)骨脂素的含量作為補(bǔ)腎壯骨膏的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，旨在為本制劑建立內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與藥品

高效液相色譜儀：W at ers系列高效液相色譜儀（W at ers 600 cont rol l er，PD A 2996型二極管陣列檢測(cè)器，Em pow er化學(xué)工作站）。SH IM A D ZU LC-2010A H T高效液相色譜儀，紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，LC-sol ut i on色譜工作站。K Q 5200B型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（110739-201115，99.3%，原中國(guó)藥品生物制品檢定所），甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

補(bǔ)腎壯骨膏（批號(hào)：20120401，20120402，2012 0403，20120404，20120405，20120406，20120501，2012 0502，20120503，20120504，九江市中醫(yī)醫(yī)院研制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Pront osi l 120-5-C18柱 （250 m m × 4.6 m m，5 μm）。流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）；流速：1.0 m L/m i n；檢測(cè)波長(zhǎng)：246 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按補(bǔ)骨脂素峰計(jì)算應(yīng)不得低于3 000。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

用PD A檢測(cè)器對(duì)補(bǔ)骨脂素對(duì)照品與樣品溶液中與補(bǔ)骨脂素對(duì)照品相應(yīng)位置上的色譜峰在400～ 210 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果均在246 nm波長(zhǎng)附近處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm。

2.3 樣品溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品10.01 m g，置 100 m L量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對(duì)照品母液。精密移取對(duì)照品母液10 m L，用甲醇定容至100 m L的容量瓶中，即得補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備裝量差異項(xiàng)下本品適量，取約 15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇100 m L，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kH z）45 m i n，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液 25 m L，蒸干，殘?jiān)铀?0 m L使溶解，水溶液用乙酸乙酯提取4次，每次30 m L，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移到10 m L容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性對(duì)照樣品溶液的制備除補(bǔ)骨脂以外，其余各藥材按補(bǔ)腎壯骨膏處方量制備陰性對(duì)照樣品，同“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制得缺補(bǔ)骨脂的陰性對(duì)照樣品溶液。

2.4 方法的專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取供試品溶液、陰性對(duì)照樣品溶液與對(duì)照品溶液各 10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果顯示補(bǔ)骨脂素峰形良好，基線平穩(wěn)，對(duì)照品、供試品在相同時(shí)間有一色譜峰，而陰性對(duì)照樣品無干擾，見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

分別吸取“2.3.1”項(xiàng)下補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液1，5，10，20 μL，對(duì)照品母液5 μL，注入液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定補(bǔ)骨脂素峰面積，以進(jìn)樣量（X）與峰面積（Y）線性回歸處理，在0.009 94～ 0.496 70 μg范圍內(nèi)補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），回歸方程為：

圖1 補(bǔ)骨脂素HPLC圖

Y=7.570 96×106X－6.895 73×103（n=5），見圖2。

圖2 補(bǔ)骨脂素線性圖

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取 “2.3.1”項(xiàng)下補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定補(bǔ)骨脂素峰面積值，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算得對(duì)照品峰面積值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為0.89%，測(cè)定方法的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在 0，1，3，5，7，9，12，24小時(shí)，精密吸取照“2.3.2”項(xiàng)下制備的供試品（批號(hào)：20120401）溶液10 μL，測(cè)定供試品溶液中補(bǔ)骨脂素峰面積值，計(jì)算供試品補(bǔ)骨脂素峰面積值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為1.27%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

裝量差異項(xiàng)下本品（批號(hào)：20120401）適量，研細(xì)，取約15 g，共6份，精密稱定，照“2.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，處理結(jié)果數(shù)據(jù)，平均含量為19.01 μg/g，RSD為1.00%，方法重現(xiàn)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

裝量差異項(xiàng)下本品（批號(hào)：20120401，補(bǔ)骨脂素含量為19.01 μg/g）適量，研細(xì)，取6份，每份約7.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入含補(bǔ)骨脂素（濃度1.457 μg/m L）對(duì)照品的70%甲醇混合溶液100.00 m L，稱定質(zhì)量，照“2.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率（見表1）。樣品中補(bǔ)骨脂素平均回收率為98.20%，RSD值為1.58%（n=6），補(bǔ)骨脂素回收率良好。

2.10 耐用性試驗(yàn)

裝量差異項(xiàng)下本品（批號(hào)：20120401，20120402）適量，研細(xì)，取約15 g，精密稱定，照“2.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別用 A：Pront osi l 120-5-C18（250 m m × 4.6 m m，5 μm），B：A gi l ent Ecl i pse X D B-C18（250 m m ×4.6 m m，5 μm），C：D i am onsi l C18（250 m m × 4.6 m m，5 μm）3種品牌的色譜柱，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定補(bǔ)骨脂素含量，補(bǔ)骨脂素含量的RSD值低于1.00%（見表2）。

2.11 樣品測(cè)定

裝量差異項(xiàng)下本品10批次，研細(xì)，各取約15 g，精密稱定，照“2.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算補(bǔ)骨脂素含量（見表3），補(bǔ)骨脂素含量在17.52～ 20.37 μg/g，10批次本品補(bǔ)骨脂素平均含量為18.89 μg/g。根據(jù)表3測(cè)定結(jié)果，考慮藥材來源、配制操作等因素的差異影響，以平均含量的80%劃作補(bǔ)腎壯骨膏中補(bǔ)骨脂素含量的限度，即規(guī)定：本品每1 g含補(bǔ)骨脂以補(bǔ)骨脂素（C11H6O3）計(jì)，不得少于15 μg。

表1 補(bǔ)骨脂素回收率測(cè)定結(jié)果

表2 不同色譜柱測(cè)定補(bǔ)骨脂素含量結(jié)果

表3 補(bǔ)腎壯骨膏中補(bǔ)骨脂素含量（n=4）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

方法學(xué)研究試驗(yàn)中，分別比較了以乙腈-水、甲醇-0.02 m ol/L磷酸氫二鉀溶液和甲醇-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相，考察補(bǔ)腎壯骨膏中補(bǔ)骨脂素的分離情況及峰形，結(jié)果以甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）為流動(dòng)相的分離情況及峰形為佳；故確定流動(dòng)相為：甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）。

3.2 供試品溶液制備的方法考察

在供試品溶液的制備方法試驗(yàn)中，分別選擇了以70%甲醇加熱回流提取60分鐘，超聲處理（功率300 W，頻率25 kH z）提取45分鐘,考察提取方式對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示這兩種提取方式差異不明顯，而超聲處理較簡(jiǎn)便易行，故選用超聲處理提取方式制備供試品溶液。分別選擇了85%乙醇、70%甲醇、甲醇為提取溶劑，考察提取溶劑對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果以70%甲醇提取效果最好。分別用乙酸乙酯分別提取3，4，5次，考察不同提取次數(shù)對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響，用乙酸乙酯提取4次即可得滿意結(jié)果。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：1175-1176.

[2] 張蕊，馮曉川，徐延昭，等.H PLC測(cè)定癃閉舒片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（21）：142-144.

[3] 張廣利.RP-H PLC法測(cè)定溫胃舒泡騰顆粒中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量[J].安徽醫(yī)藥，2010，14（11）：1288-1290.

Content Determination of Psoralen in Bushen Zhuanggu Plaster by HPLC

Lai Ji eren（Tradi t i onal Chi nese M edi ci ne H ospi t al of Ji uj i ang Ci t y，Ji angxi Ji uj i ang 332000，Chi na）

Objective:To est abl i sh a H PLC m et hod for t he cont ent det erm i nat i on of psoral en i n bushen zhuanggu pl ast er.Methods:H PLC w as carri ed out on Pront osi l 120-5-C18col um n （250 m m × 4.6 m m，5 μm）w i t h a m obi l e phase of m et hanol-0.2% phosphori c aci d （45∶55）,t he fl ow rat e w as 1.0 m L/m i n at U V det ect i on w avel engt h of 246 nm，t he col um n t em perat ure w as at 30℃，and t he sam pl e si ze w as 10 μL.Results:A good l i near rel at i onshi p of t he reference m at eri al of psoral en w as obt ai ned w i t hi n t he range of 0.009 94～ 0.496 70 μg，r=0.999 9.The average recovery of psoral en i s 98.20%，RSD=1.58% （n=6）.Conclusion:The m et hod i s conveni ent，accurat e and speci fi c w i t h a good reproduci bi l i t y,i t i s sui t abl e for t he cont ent det erm i nat i on of psoral en i n bushen zhuanggu pl ast er.

Bushen Zhuanggu Pl ast er；Psoral en；Cont ent D et erm i nat i on；H PLC

10.3969/j.i ssn.1672-5433.2015.04.005

2015-01-06）

賴杰仁，男，碩士，副主任藥師。研究方向：中藥新制劑與新技術(shù)。E-m ai l：sm z_l ai@163.com