杜欣軍，王學連，李 萍，耿潔潔，張洪娟，王 碩

（天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津 300457）

奶牛乳房炎（Mastitis）在世界各國都是影響牛奶生產(chǎn)的最為重要的疾病之一［1］，也是造成經(jīng)濟損失最多的一種疾病，全球每年因乳房炎造成的損失約為350億美元［2］。近年來，我國奶牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但是由于技術(shù)水平、養(yǎng)殖條件等方面的限制，我國因乳房炎造成的經(jīng)濟損失約100億元［3］。金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎最常見的致病菌之一，可直接影響奶牛的產(chǎn)奶量、奶品質(zhì)，最終造成奶品質(zhì)低下，甚至棄用，并因為投入巨大的醫(yī)療費用而造成經(jīng)濟損失［4］。金黃色葡萄球菌已成為阻礙奶牛業(yè)發(fā)展的一種重要危害因素。

金黃色葡萄球菌含有多種表面蛋白，如凝集因子 A（clumping factor A，ClfA）、凝集因子 B（clumping factor B，ClfB）、膠原結(jié)合蛋白（collagen adhesion，Cna）、纖連蛋白結(jié)合蛋白 A（fibronectin-binding protein A，F(xiàn)nBPA）、纖連蛋白結(jié)合蛋白 B（fibronectin-binding protein B，F(xiàn)nBPB）、鐵調(diào)節(jié)表面決定子 A（iron-regulated surface protein A，IsdA）、鐵調(diào)節(jié)表面決定子B（iron-regulated surface protein B，IsdB）、絲氨酸-天冬氨酸重復蛋白家族（serine-aspartate repeat-containing protein，Sdr）等［5］。Sdr蛋白家族是識別細胞外基質(zhì)分子的微生物表面組分，其名稱的由來是因為其R區(qū)基因能夠編碼包含多個絲氨酸-天冬氨酸的多肽。Sdr基因簇由3部分組成，分別為sdrC（2.8bp）、SdrD（3.9bp）和sdrE（3.5bp）［6］。雖然Sabat A 等［6］研究表明并不是所有的金黃色葡萄球菌菌株都含有sdrC、SdrD和sdrE基因，但是很多研究表明該類蛋白能夠起到較好的免疫保護作用。Stranger-Jones Y K 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，用IsdA、IsdB、SdrD和SdrE蛋白免疫小鼠能夠獲得很強的免疫應答反應，4種表面蛋白制備的復合疫苗能夠產(chǎn)生很高水平的保護作用。Becherelli M 等［8］研究指出，3種 Sdr蛋白 （SdrC、SdrD 和SdrE）的保守結(jié)構(gòu)域 CnaBE3（the third B repeat of SdrE）對于金黃色葡萄球菌的感染具有明顯的免疫保護作用。此外，Trad S J等［9］研究指出，SdrD 基因與骨感染有很大的關(guān)系。以上研究表明，SdrD是一種重要的金黃色葡萄球菌表面蛋白，該蛋白在基因工程疫苗開發(fā)、檢測技術(shù)建立及金黃色葡萄球菌致病機制的深入研究方面都具有重要的價值。

本研究克隆了SdrD基因，對該基因進行了原核表達，并制備了多克隆抗體，為金黃色葡萄球菌保護性疫苗的開發(fā)、免疫檢測技術(shù)的建立奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC25923、ATCC49521、ATCC55804、ATCC49525，ATCC 公司產(chǎn)品；金黃色葡萄球菌地方分離菌株由本實驗室保存；載體pET26b，Novagen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 SdrD的基因克隆 將4株金黃色葡萄球菌標準菌株及地方分離菌株過夜培養(yǎng)，用基因組DNA提取試劑盒（天根）提取其基因組。

根據(jù)SdrD基因設(shè)計特異性引物，并以提取的基因組為模板擴增其基因片段。

所用引物：SdrD F：TACTCAgaattg-GCAGAAAGTACTAATAAAGAATTG（小寫字母為EcoRⅠ酶切位點）；SdrD R：TACTCActcgagTTTATAAGTTCCATTTTCTAATCC（小 寫字母為XhoⅠ酶切位點）。

PCR反應程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃50s，進行35個循環(huán)；72℃10min。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET26b-SdrD的構(gòu)建 將回收的SdrD片段與載體pET26b用EcoRⅠ和XhoⅠ進行酶切，純化回收后進行連接。轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α后篩選陽性克隆，并對重組質(zhì)粒進行PCR和雙酶切鑒定。

1.2.3 SdrD蛋白的誘導表達 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET26b-SdrD轉(zhuǎn)入大腸埃希菌表達菌株BL21（DE3）中，加入終濃度為0.1mmol／L的IPTG誘導5h，SDS-PAGE檢測蛋白表達情況。

選取終濃度分別為 0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mmol／L的IPTG誘導表達蛋白SdrD。并用Image Lab軟件進行相對定量分析，確定IPTG的最佳濃度。

1.2.4 SdrD表達形式的檢測 將加入IPTG誘導表達后的pET26b-SdrD-BL21（DE3）進行超聲破碎，離心分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE。

1.2.5 表面蛋白SdrD的純化 將表達的SdrD蛋白用帶有Ni-NTA柱進行純化，并進行SDS-PAGE檢測。

1.2.6 多克隆抗體的制備 將純化的蛋白SdrD用來免疫注射新西蘭白兔，免疫注射5次后取動物全血，分離血清。獲得的兔血清用ProteinA柱子進行純化。

2 結(jié)果

2.1 SdrD基因的克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中SdrD基因序列，利用Primer5.0設(shè)計引物，以金黃色葡萄球菌標準菌株和地方分離菌株基因組為模板，對SdrD基因進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，在所有菌株中都能夠獲得大小約為2 000bp片段，與預期擴增的基因片段大?。? 043bp）一致（圖1、圖2）。

2.2 重組質(zhì)粒pET26b-SdrD的構(gòu)建

將擴增的片段進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，并與載體進行連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α后進行PCR篩選。將篩選出的陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行PCR和雙酶切驗證，結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖3、圖4）。

圖1 從金黃色葡萄球菌標準菌株中擴增SdrD基因片段Fig.1 Amplification of SdrD gene fragments from S.aureus standard strains

圖2 從金黃色葡萄球菌地方分離菌株中擴增SdrD基因片段Fig.2 Amplification of SdrD gene fragments fromS.aureus isolates

2.3 SdrD蛋白的表達

將重組質(zhì)粒pET26b-SdrD轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21（DE3）中，IPTG終濃度為0.1mmol／L進行誘導表達，SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，在116.0ku的下方出現(xiàn)一條電泳條帶，與預期的蛋白大?。s99ku）一致（圖5）。

2.4 誘導SdrD蛋白表達IPTG濃度的優(yōu)化

將pET26b-SdrD-BL21（DE3）培養(yǎng)至對數(shù)期，37℃ 以IPTG誘導表達5h，IPTG的終濃度分別為0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mmol／L，用 SDS-PAGE進行檢測，然后用Image Lab軟件進行相對定量分析。結(jié)果顯示IPTG的濃度對蛋白SdrD表達量影響不大（圖6）。

圖3 重組質(zhì)粒pET26b-SdrD的PCR驗證Fig.3 PCR verification of recombinant plasmid SdrD-pET26

圖4 重組質(zhì)粒pET26b-SdrD的雙酶切驗證Fig.4 Restrictive digestion of recombinant plasmid pET26b-SdrD

圖5 SdrD蛋白的重組表達Fig.5 Recombinant expression of SdrD protein

圖6 不同IPTG濃度誘導SdrD蛋白的表達Fig.6 SdrD protein expression induced by different concentrations of IPTG

2.5 SdrD蛋白的表達形式

將BL21（DE3）-pET26b-SdrD用IPTG進行誘導表達，取誘導后的菌液進行超聲破碎，然后取上清和沉淀進行SDS-PAGE。結(jié)果表明，SdrD蛋白主要在上清中，即重組SdrD蛋白為可溶性表達（圖7）。

圖7 SdrD蛋白的表達形式分析Fig.7 Analysis of expression of SdrD protein

2.6 SdrD蛋白的純化

將表達的SdrD蛋白用Ni-NTA His Resins柱子進行純化，然后取不同管的純化收集液進行SDSPAGE，結(jié)果顯示均是單一條帶，說明純化效果良好（圖8）。

圖8 純化的SdrD蛋白的SDS-PAGE檢測Fig.8 SDS-PAGE analysis of purified SdrD protein

2.7 多克隆抗體的制備

用間接ELISA檢測免疫注射后新西蘭白兔的血清抗體效價，結(jié)果如表1所示。

表1 SdrD蛋白免疫兔血清效價測定Table 1 Detection of titers of the antisera after immunization with SdrD protein in rabbit

如表1所示，隨著免疫時間的延長，抗體滴度呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，而后上升幅度變小。兔-1的效價高于兔-2。

3 討論

奶牛乳房炎已成為乳品工業(yè)發(fā)展的最大危害因素之一，目前對于乳房炎的防治主要以抗菌藥物為主，但是大量使用抗菌藥物導致了致病菌的耐藥性，并導致了牛奶中抗生素大量殘留，造成嚴重的食品安全隱患。疫苗在奶牛中的成功應用，為奶牛乳房炎的防治另辟了途徑，針對奶牛乳房炎的主要致病菌開發(fā)保護性疫苗具有廣闊的應用前景。有研究表明，在某些地區(qū)19%奶牛乳房炎是由金黃色葡萄球菌引起的，因此，開發(fā)金黃色葡萄球菌疫苗將能夠在較大程度上預防乳房炎的發(fā)生。

表面蛋白暴露于微生物表面，能夠被宿主免疫系統(tǒng)較好的識別，因此這類蛋白被認為是理想的候選疫苗。有研究證實，表面蛋白SdrD具有良好的免疫保護作用［7-8］，因此這種蛋白在基因工程疫苗研究領(lǐng)域具有重要的潛在應用價值。但是，疫苗的高效、低成本制備是決定其能否得到推廣應用的關(guān)鍵因素。在所有重組表達體系中，原核重組表達系統(tǒng)具有操作簡便、表達量高、制備成本低、制備周期短的顯著優(yōu)勢。本研究選擇了成熟、穩(wěn)定的pET系列表達載體，較好的滿足了基因疫苗制備的要求，是一種具有推廣應用潛力的制備方式。

在原核表達體系中，目標蛋白往往容易形成包涵體，并且分子質(zhì)量高的蛋白更易形成包涵體，包涵體的形成對于目標蛋白的分離純化帶來了較大困難，同時由于其結(jié)構(gòu)為非天然狀態(tài)，將會在較大程度上影響其免疫原性。因此，包涵體的形成對于高活性基因工程疫苗的制備具有較大的負面影響。本研究所選擇的pET26b表達載體帶有能夠形成含有膜間隙定位信號的融合標簽，在很大程度上提高了形成可溶性蛋白的幾率。本研究結(jié)果表明，雖然目標蛋白的分子質(zhì)量較大（99ku），但是大部分蛋白均以可溶性形式表達。本研究所建立的可溶性表達體系對于SdrD這一候選疫苗的應用提供了更好的技術(shù)保障。

一些表面蛋白在細菌表面的暴露程度較高，并且其中有些表面蛋白具有一定的特異性，因此表面蛋白是一類重要的免疫檢測靶標。迄今已經(jīng)有一些研究利用表面蛋白作為靶標建立了針對細菌、支原體、寄生蟲的免疫檢測方法，這些方法體現(xiàn)出較好的特異性與檢測靈敏度［10-12］。本研究表達了金黃色葡萄球菌的表面蛋白SdrD，并制備了效價較高的多克隆抗體，為這一致病菌的快速檢測奠定了良好的基礎(chǔ)。

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