譚 丹，黃建龍，王昌建，何世成，王衛(wèi)國，唐小明，朱春霞，范仲鑫，汪洪冰，劉道新＊，鄧國華

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室／獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150001；2.長沙市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410006；3.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410129）

禽流感是由正黏病毒科A型流感病毒屬禽流感病毒引起的一種禽類（家禽和野禽）傳染病［1］，禽流感病毒在野生水鳥、大多數(shù)家養(yǎng)水禽、海鷗中廣泛存在［2-3］。由于其基因組的分節(jié)段性及復(fù)制過程中RNA聚合酶缺乏矯正功能，導(dǎo)致AIV變異頻繁［4］。一直以來高致病性禽流感對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的嚴(yán)重危害性和公共衛(wèi)生意義倍受關(guān)注。而低致病性禽流感病毒感染家禽后表現(xiàn)溫和，但仍存在潛在的臨床危險(xiǎn)，有可能為高致病性禽流感病毒形成提供基因片段，間接地導(dǎo)致禽流感的暴發(fā)流行［5］。

禽流感毒株基因的頻繁變異給禽流感的防控帶來非常大的難度。本研究對(duì)近年來由湖南省洞庭湖區(qū)的正常監(jiān)測樣品中分離的2株H11N9亞型禽流感毒株進(jìn)行HA、NA基因序列比較分析和對(duì)SPF雞致病性的研究，旨在從分子生物學(xué)角度了解H11N9亞型禽流感在湖南省洞庭湖區(qū)的變異特點(diǎn)、進(jìn)化規(guī)律及致病性特征，為該地區(qū)禽流感的防控提供一些理論依據(jù)，從而有效預(yù)防和控制禽流感，保護(hù)人類健康和公共衛(wèi)生安全。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 2株H11N9亞型禽流感病毒均來自湖南省洞庭湖區(qū)正常監(jiān)測樣品，由哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室分離保存，病毒命名為：A／DK／HuN／S4013／2011 （H11N9） （簡 寫 為HuN20114013）； A ／DK／HuN／ S4443／2011（H11N9）（簡寫為 HuN20114443）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 11日齡SPF雞胚和4周齡SPF雞由哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖 病毒經(jīng)血凝抑制試驗(yàn)及PCR擴(kuò)增鑒定為H11N9亞型，按104～109有限稀釋度接種10日齡SPF接胚，每次收取有血凝價(jià)且最高稀釋度的雞胚尿囊液作為下一次純化種毒，如此純化3次后，以最適合的稀釋度接種11日齡SPF雞胚，48h后收取雞胚尿囊液，收集的尿囊液經(jīng)過HA-HI試驗(yàn)驗(yàn)證及無菌檢測后，分裝，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的回收 根據(jù)GenBank中H11N9亞型禽流感病毒各基因片段序列選擇同源性最高的區(qū)域設(shè)計(jì)引物。PCR擴(kuò)增HA、NA基因片段后，PCR產(chǎn)物在10g／L瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析鑒定結(jié)果，然后按照試劑盒說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收。

1.2.3 HA基因序列的測定 紫外透射儀測定PCR產(chǎn)物的濃度并按測序要求計(jì)算所需DNA量，PCR反應(yīng)結(jié)束后加入2.0μL終止液。測序反應(yīng)產(chǎn)物在終止反應(yīng)后加入60μL 950mL／L冰乙醇，混勻于-20 ℃ 15min后，12 000r／min 4 ℃ 下 離 心20min，小心棄去上清，加70μL 700mL／L冰乙醇，12 000r／min 4℃下離心10min洗脫殘留的鹽，重復(fù)1次，倒于紙上室溫晾干，加入15μL甲酰胺，使DNA沉淀充分溶解，最后全部加入測序板內(nèi)，并進(jìn)行高溫變性，采用ABI測序儀進(jìn)行測序。

1.2.4 序列的拼接和分析 病毒各基因片段序列采用DNA Star軟件中Seqman程序?qū)y定各個(gè)基因的原始序列進(jìn)行拼接，采用MegAlign程序?qū)Ω鱾€(gè)基因片段進(jìn)行核苷酸及氨基酸的同源性比較；應(yīng)用Mega 5軟件包對(duì)病毒各個(gè)基因進(jìn)行多序列比對(duì)和進(jìn)化樹的繪制與分析。

1.2.5 SPF雞感染試驗(yàn) 按每只106EID50／100μL的病毒懸液鼻腔接種11只SPF雞，同時(shí)放入2只SPF雞作為同居感染對(duì)照，于負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)。感染后每隔24h采集泄殖腔和喉頭拭子放入1mL的含有雙抗的PBS中，置-80℃保存，連續(xù)采集14 d，拭子接種雞胚進(jìn)行病毒滴度測定，以分析其排毒規(guī)律。雞感染后第3天，每個(gè)病毒感染雞群隨機(jī)處死3只雞，取組織臟器（腦、胸腺、氣管、心、肝、脾、肺、腎、胰臟、盲腸扁桃體、法氏囊）用于病毒分離滴定。

2 結(jié)果

病毒的核苷酸序列分析表明，湖南分離的2株H11N9病毒HA基因開放性閱讀框?yàn)? 698bp，共編碼565個(gè)氨基酸，其NA開放閱讀框?yàn)? 713bp，共編碼470個(gè)氨基酸。

2.1 基因裂解位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)變異情況

分離的2株H11N9病毒HA裂解位點(diǎn)都為PAIASR／GLF，沒有多個(gè)堿性氨基酸的插入。2株病毒HA基因均有7個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，即26（NNS）、27（NST）、39（NVT）、181NNT）、305（NKS）、496（NGT）和556（NGS）。NA基因上均有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分別為42、52、63、66、87、147、202。HA基因上受體結(jié)合位點(diǎn)（以人H3計(jì)）T98、T136、A138、S144、W153、H156、Q157、Y161、H183、K189、E190、L194、G225、Q226、A227、G228基本都保守，除HuN20114443受體結(jié)合位點(diǎn)144（S）發(fā)生改變?yōu)镹，所有這些位點(diǎn)均不具備人受體結(jié)合位點(diǎn)。NA基因上的HB受體結(jié)合位點(diǎn)均沒發(fā)生突變（表1和表2）。

表1 HA基因特征位點(diǎn)氨基酸序列分析Table 1 The analysis of special sites of amino acids in HA gene

表2 NA基因特征位點(diǎn)氨基酸序列分析Table 2 The analysis of special sites of amino acids in NA gene

2.2 HA和NA基因的同源性及遺傳進(jìn)化關(guān)系

對(duì)2株H11N9病毒HA序列進(jìn)行遺傳演化分析，2株核苷酸同源性為87.0%之間，與參考毒株HA基因序列同源性在88.0%～96.7%，主要分為2大分支，Ⅰ與Ⅱ分支核苷酸同源性較低，同源性在88.0%～89.5%之間，與日本、澳大利亞、越南、荷蘭等國家H11參考毒株關(guān)系比較密切，可能有共同的祖先來源（圖1）。將與其同源性相近的毒株進(jìn)行進(jìn)化樹分析，這2株NA基因同源性在96.4%之間，處于同一分支株，均與在周邊國家野鳥中分離的H11N9亞型毒株關(guān)系密切，與其核苷酸同源性在95.9%～98.2%（圖2）。

圖1 HA基因進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of HA gene

圖2 NA基因進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of NA gene

2.3 感染雞臨床癥狀及排毒情況

2株H11N9亞型禽流感毒株鼻腔接種SPF雞后，HuN20114443毒株能使雞感染并通過喉頭和泄殖腔排毒，但HuN20114013毒株不引起雞泄殖腔排毒，只能在喉頭樣品中檢測到H11N9亞型禽流感病毒，感染的雞均不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。對(duì)感染雞的排毒情況進(jìn)行連續(xù)觀察，排毒期主要集中在1d～4d。對(duì)同居雞的喉頭和泄殖腔樣品也進(jìn)行了檢測，均不能檢測到H11N9亞型禽流感病毒，可判斷這2株H11N9亞型禽流感毒株均不能使同居雞感染排毒，說明這些毒株在雞群中不具有水平傳播能力。從感染雞臟器中病毒的復(fù)制情況看，在2個(gè)毒株感染雞的腦、肺臟、肝臟、心臟、腎臟、脾臟、胰腺、法氏囊等組織臟器中均未檢到病毒復(fù)制。

3 討論

HA是AIV毒力和宿主特異性的主要決定因素［6］，大多數(shù)高致病力毒株的HA在其裂解位點(diǎn)附近有多個(gè)堿性氨基酸插入，在無類胰蛋白酶的情況下就能發(fā)生裂解，造成感染禽全身系統(tǒng)衰竭，導(dǎo)致死亡。分離的2株H11N9亞型禽流感毒株的HA裂解位點(diǎn)為PAIASR／GLF，均沒有多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸插入，屬于低致病性病毒。因此，在這2株H11N9亞型禽流感毒對(duì)SPF雞致病性的試驗(yàn)中，只引起SPF雞短暫的排毒，而感染的雞均不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。

有研究表明流感病毒HA受體特異性及NA唾液酸酶活性劑特異性與病毒感染的宿主范圍、組織嗜性及致病力的強(qiáng)弱有關(guān)［7-8］。HuN20114443株毒株能使雞感染并通過喉頭和泄殖腔排毒，但HuN20114013毒株不引起雞泄殖腔排毒，只能在喉頭樣品檢測到H11N9亞型禽流感病毒。本研究2株H11N9毒株其HA的受體結(jié)合位點(diǎn)均非常保守，HuN20114443受體結(jié)合位點(diǎn)144（S）發(fā)生改變?yōu)镹，是否是由于該位點(diǎn)基因發(fā)生突變而導(dǎo)致這2株毒株引起SPF雞排毒差異還有待研究。

湖南洞庭湖地區(qū)作為“東亞-澳大利亞遷徙線”上候鳥和我國候鳥遷徙主要停歇地，候鳥在禽流感跨地域傳播中起著很重要的作用［9］。有許多研究表明，在候鳥遷徙地分離的毒株均被發(fā)現(xiàn)有不同亞型或同亞型不同基因之間的重組現(xiàn)象［10-11］。本研究中NA基因組序列進(jìn)行遺傳演化分析來看，這2株H11N9亞型禽流感毒株與在周邊國家野鳥中分離的H11N9亞型毒株關(guān)系密切，與其核苷酸同源性在95.7%～98.2%，說明這些不同亞型毒株之間可能發(fā)生了NA基因的重排。提示該地區(qū)長期的野鳥遷徙對(duì)家鴨AIV的感染影響很大，同時(shí)這些毒株在家禽中相互循環(huán)使得其內(nèi)部基因有所變異。因此，繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)該地區(qū)流感病毒的監(jiān)測顯然具有重要的公共衛(wèi)生意義。

［1］甘孟侯.禽流感［M］.北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002：74-78.

［2］Rachelle R，Webster R G.The influenza virus enigma［J］.Cell，2009，136（3）：402-410.

［3］Ducatez M F，Webster R G，Webby R J.Animal influenza epidemiology［J］.Vaccine，2008，26（4）：67-69.

［4］崔尚金.我國禽流感的流行病學(xué)調(diào)查［D］.黑龍江哈爾濱：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，2005.

［5］Cheng C L，Vijaykrishna D，Smith G J，et al.Establishment of influenza virus（H6N1）in minor poultry species in sourthern China［J］.J Virol，2007，10：10402-10412.

［6］賈紅玲，蘇 艷，吳 潤，等.禽流感病毒血凝素保守氨基酸對(duì)其受體結(jié)合位點(diǎn)的影響［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30（7）：500-504.

［7］Weis W，Brown J H，Cusack S，et al.Structure of the influenza virus haemagglutinin complexed with its receptor，sialic acid［J］.Nature，1988，333（6172）：426-431.

［8］李井春，趙鳳菊，于學(xué)成，等.野鳥在禽流感流行病學(xué)中的作用研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（7）：178-180.

［9］Ward M J，Lycett S J，Avila D，et al.Evolutionary interac-tions between haemagglutinin and neuraminidase in avian influenza［J］.BMC Evol Biol，2013，13：222.

［10］Zhu Y，Hu S，Bai T，et al.Phylogenetic and antigenic characterization of reassortant H9N2avian influenza viruses isolated from wild waterfowl in the East Dongting Lake wetland in 2011-2012［J］.Virol J，2014，11（1）：77.

［11］Deng G，Tan D，Shi J，et al.Complex reassortment of multiple subtypes of avian influenza viruses in domestic ducks at the Dongting Lake Region of China［J］.J Virol，2013，87（17）：9452-9462.