姚茹+黎祖福+饒科

摘要：通過(guò)在貝類養(yǎng)殖過(guò)程中投放微藻、益生菌等微生物制劑，測(cè)定生態(tài)制劑對(duì)貝類養(yǎng)殖環(huán)境、重金屬、病原微生物等有害物質(zhì)含量差異的影響。結(jié)果表明，微生態(tài)制劑顯著改善了養(yǎng)殖水質(zhì)，試驗(yàn)組氨態(tài)氮、亞硝酸鹽、化學(xué)需氧量的含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），其移除率分別達(dá)到21%～38%、26%～44%、11%～25%。經(jīng)過(guò)3個(gè)月的凈化，試驗(yàn)組近江牡蠣體內(nèi)重金屬含量顯著下降，其增肥率則顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。因此貝類生態(tài)凈化技術(shù)能有效地降低水中氨態(tài)氮、亞硝酸鹽、化學(xué)需氧量的含量，同時(shí)降低牡蠣體內(nèi)重金屬含量，提高其增肥率，提升牡蠣品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：近江牡蠣;養(yǎng)殖水質(zhì);重金屬含量;微藻;益生菌

中圖分類號(hào)： S968.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0286-03

收稿日期：2014-05-09

基金項(xiàng)目：廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)（編號(hào)：A201101G01）。

作者簡(jiǎn)介：姚 茹（1963—），女，廣東廣州人，高級(jí)工程師，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖研究。E-mail：gdgzyao@yeah.net。

我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量居世界第一位，而貝類在我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有十分重要地位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年我國(guó)海水貝養(yǎng)殖產(chǎn)量1 108.23萬(wàn)t，占全國(guó)海水養(yǎng)殖產(chǎn)量的74.76%。海水貝類養(yǎng)殖面積130.8萬(wàn)hm2，占全國(guó)海水養(yǎng)殖面積的6286%[1]。因此，貝類養(yǎng)殖的好壞關(guān)系到我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的成敗。

雖然近幾十年來(lái)我國(guó)海水貝類養(yǎng)殖業(yè)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，然而隨著我國(guó)沿海地區(qū)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，沿海水域環(huán)境污染日益嚴(yán)重，貝類受污染的問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重。這一問(wèn)題不僅制約了我國(guó)貝類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，使我國(guó)貝類養(yǎng)殖業(yè)遭受到了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也帶來(lái)了一系列的公眾食品安全問(wèn)題。例如，1989年上海就有30萬(wàn)人因食用受病毒污染的貝類而患病[2]，歐盟則因?yàn)槲覈?guó)出口貝類的食品安全問(wèn)題自1997年起便終止了進(jìn)口中國(guó)貝類產(chǎn)品。

一般而言，污染貝類物質(zhì)的來(lái)源可以分為3類：來(lái)源于工業(yè)污染物的重金屬、農(nóng)藥、石油烴等;來(lái)源于生活污水的微生物污染物;來(lái)源于赤潮的生物性毒素污染物[3]。其中，來(lái)源于工業(yè)污染物的重金屬不僅具有生物富集、放大性、持久性等特點(diǎn)，而且特別容易積累在牡蠣和貽貝等濾食性動(dòng)物中。因此近年來(lái)貝類的重金屬污染已受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[4-5]。王增煥等通過(guò)1997—2010年對(duì)廣東沿海近江牡蠣金屬含量的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，近江牡蠣體內(nèi)的Cu、Zn含量分別達(dá)到了72.3、203.0 mg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了其他生物體內(nèi)的含量[4]。程華勝通過(guò)累積和排除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)近江牡蠣對(duì)Cu、Pb、Zn、Cd 4種金屬的積累是凈累積型，其體內(nèi)金屬含量與暴露時(shí)間長(zhǎng)短有顯著的正相關(guān)[6]。

隨著城市污水排放的增加，我國(guó)沿海貝類受來(lái)源于生活污水的微生物污染情況也不斷加重。蔡友瓊等在1998—2001年通過(guò)對(duì)江蘇、浙江、福建和青島等沿海地區(qū)貝類微生物污染的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，青島貝類大腸桿菌超標(biāo)率高達(dá)90%，其細(xì)菌總數(shù)在104～106之間，浙江、福建等地的貝類細(xì)菌總數(shù)也達(dá)到了104左右[3]。

除了重金屬污染之外，近年來(lái)隨著近岸海水富營(yíng)養(yǎng)化程度的不斷加重以及越來(lái)越頻繁赤潮的發(fā)生，生物性毒素污染也日益威脅到貝類的食品安全。當(dāng)貝類濾食有毒微藻時(shí)，微藻產(chǎn)生的毒素便會(huì)累積在貝類體內(nèi)。例如，世界上分布最廣的麻痹性貝類毒素PSP便是來(lái)源于產(chǎn)生赤潮的有毒甲藻，貝類通過(guò)攝食這些甲藻的細(xì)胞和胞囊，毒素在其體內(nèi)累積并沿著食物鏈向高營(yíng)養(yǎng)級(jí)的生物傳遞[7]。

綜上所述，貝類污染不僅嚴(yán)重威脅到人民群眾的食品安全而且還制約著我國(guó)貝類養(yǎng)殖的健康發(fā)展;因此，研究牡蠣凈化技術(shù)提高貝類品質(zhì)有著重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。目前貝類凈化采取的方法主要是針對(duì)微生物污染所采取的臭氧法、紫外線法、氯消毒法等物理化學(xué)方法[2，8-9]，針對(duì)重金屬污染以及從根本上改善養(yǎng)殖水質(zhì)的凈化技術(shù)卻鮮有研究。為更好地解決上述問(wèn)題，本試驗(yàn)通過(guò)篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)微藻和益生菌并將其投入到近江牡蠣（Crassostrea rivularis）養(yǎng)殖水體中，同時(shí)監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖水體中水質(zhì)狀況以及近江牡蠣凈化后重金屬含量、細(xì)菌含量、增肥率的變化。

1 材料與方法

1.1 凈化工藝流程

引入魚塭海水→經(jīng)網(wǎng)濾→凈化室→接入藻種和益生菌→放養(yǎng)瘦蠔→每周補(bǔ)充藻種和益生菌→收獲肥蠔。

1.2 微藻益生菌制劑的來(lái)源

試驗(yàn)所用濃縮微藻由筆者所在研究組自廣東省陽(yáng)東縣一景園蠔苗良種場(chǎng)池塘中分離、篩選、培養(yǎng)研制而成。微藻包含亞心形扁藻、小球藻、金藻以及角毛藻。益生菌則使用廣州綠海生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的蝦蟹寶以及南海牌利生素。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2013年11月至2014年2月于廣東省陽(yáng)東縣一景園蠔苗良種場(chǎng)4個(gè)室內(nèi)試驗(yàn)池中進(jìn)行，每個(gè)試驗(yàn)池面積均為30 m2。試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，試驗(yàn)組有3個(gè)平行。2013年11月15日4個(gè)試驗(yàn)池放入牡蠣之后開始試驗(yàn)。每個(gè)試驗(yàn)池中放入大小相似的近江牡蠣250個(gè)，隨后3個(gè)試驗(yàn)組試驗(yàn)池中分別加入益生菌和微藻，其中益生菌制劑蝦蟹寶的使用量為10 mg/L，利生素的使用量為2 mg/L，再分別加入亞心形扁藻、小球藻、金藻以及角毛藻，使微藻的數(shù)量達(dá)到150萬(wàn)/mL。對(duì)照組試驗(yàn)池的微藻及有機(jī)碎屑來(lái)源于魚塭水體，數(shù)量約為10萬(wàn)/mL。在4個(gè)試驗(yàn)池底部持續(xù)進(jìn)行鼓氣充氧。此后每周均補(bǔ)種1次，維持試驗(yàn)池微藻和益生菌的濃度。每半個(gè)月?lián)Q水1次，換水前測(cè)定4個(gè)池塘中氨態(tài)氮、亞硝酸鹽、化學(xué)需氧量、溶解氧的濃度。其中氨態(tài)氮的測(cè)定采用靛酚藍(lán)分光光度法，亞硝酸鹽的測(cè)定采用鹽酸萘乙二胺分光光度法，化學(xué)需氧量（COD）的測(cè)定采用堿性高錳酸鉀法，溶解氧的測(cè)定采用溶解氧電極法。endprint

1.4 近江牡蠣樣品檢測(cè)

在凈化試驗(yàn)前后分別采樣1次，在每個(gè)試驗(yàn)池中隨機(jī)取3個(gè)近江牡蠣，現(xiàn)場(chǎng)用海水沖洗表面，去除表面污損物后，用百分天平（精確到0.01g）稱量近江牡蠣的總質(zhì)量，隨后小心去掉貝殼，稱量近江牡蠣的軟體質(zhì)量，并計(jì)算增肥率。解剖出的軟體組織-20 ℃保存，解凍后制成勻漿測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。按GB 17378.6—2007《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第6部分 生物體分析》8.2檢測(cè)鎘、鉻、汞、鉛、銅、鋅等含量，按GB 4789.3—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》檢測(cè)大腸桿菌。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

各月份試驗(yàn)組水質(zhì)指標(biāo)與對(duì)照組水質(zhì)指標(biāo)的比較，牡蠣重金屬含量的比較均采用t檢驗(yàn)，顯著指標(biāo)為P<0.05。數(shù)據(jù)分析和作圖使用Excel軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 微藻益生菌的海水凈化效果

2.1.1 海水氨態(tài)氮濃度的變化 如圖1所示，從2013年11月到2014年2月無(wú)論是試驗(yàn)組還是對(duì)照組氨態(tài)氮濃度都有上升的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)殡S著牡蠣的成長(zhǎng)，其排氨量不斷升高。然而這一段時(shí)間內(nèi)，試驗(yàn)組氨態(tài)氮濃度都顯著低于對(duì)照組氨態(tài)氮濃度（P<0.05），在2014年1月微藻和益生菌的效果更為明顯。因此可以看出微藻和益生菌的投放對(duì)降低池塘氨態(tài)氮濃度效果顯著。

2.1.2 亞硝酸鹽變化 如圖2所示，2013年11月至2014年2月間，試驗(yàn)池的亞硝酸鹽變化沒(méi)有很明顯的規(guī)律，這可能是因?yàn)樵囼?yàn)池的亞硝酸鹽含量易受引入海水的影響。在此期間，試驗(yàn)組亞硝酸鹽濃度顯著低于對(duì)照組（P<0.05），其中第3次采樣試驗(yàn)組的亞硝酸鹽濃度與對(duì)照組差異極顯著（P<0.01）。

2.1.3 化學(xué)需氧量（COD）的變化 無(wú)論是試驗(yàn)組的試驗(yàn)池還是對(duì)照組的試驗(yàn)池，其化學(xué)需氧量（COD）的變化均較?。▓D3），其中試驗(yàn)組試驗(yàn)池的COD基本保持在2.0～2.5 mg/L，而對(duì)照組試驗(yàn)池保持在2.5～3.3 mg/L，t檢驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)組COD濃度始終顯著小于對(duì)照組的COD濃度（P<0.05）。

2.1.4 溶解氧濃度 與上述水質(zhì)指標(biāo)不同的是，試驗(yàn)組和對(duì)照組的溶解氧濃度無(wú)顯著性差異（P>0.05），且各采樣間溶解氧差異也不大（圖4），這可能是因?yàn)槌掷m(xù)充氧使試驗(yàn)池溶解氧濃度保持在較高水平。

2.2 牡蠣的生態(tài)凈化效果和增重效果

微生物制劑對(duì)牡蠣的生態(tài)凈化效果如表1所示。由表1可知，對(duì)照組的鋅、鎘、鉛、銅、汞含量在養(yǎng)殖過(guò)程中都有不同程度的上升，而鉻以及大腸桿菌的含量有所下降。相較于對(duì)照組，試驗(yàn)組無(wú)論是金屬元素還是大腸桿菌含量都顯著下降（P<0.05），試驗(yàn)組鉻元素的含量甚至低于檢出限。此外，試驗(yàn)組牡蠣增肥率顯著大于對(duì)照組（P<0.05），因而生態(tài)凈化在凈化和增肥方面都達(dá)到了理想的效果。

表1 牡蠣生態(tài)凈化和增重效果

凈化指標(biāo) 試驗(yàn)前

試驗(yàn)后

試驗(yàn)組 對(duì)照組

鋅 Zn（mg/kg） 361±5.44 40±6.94 400±7.44

鎘 Cd（mg/kg） 0.91±0.21 0.59±0.12 1.5±0.25

鉛 Pb（mg/kg） 4.3±1.11 0.95±0.54 5.6±1.82

銅 Cu（mg/kg） 174±6.77 2.9±1.53 150±6.43

鉻 Cr（mg/kg） 0.7±0.11 <0.04 0.43±0.17

汞 Hg（mg/kg） 0.024 9±0.01 0.015±0.01 0.05±0.02

大腸桿菌（MPN/g） 9.30±0.98 2.30±0.35 6.00±0.63

增肥率（%） 12.25±2.64 9.04±0.97

3 討論

3.1 微藻益生菌對(duì)水質(zhì)的改善

馮俊榮等通過(guò)向養(yǎng)殖水體、飼料中投放含芽孢桿菌、乳酸菌的微生態(tài)制劑，發(fā)現(xiàn)微生態(tài)制劑可以顯著降低水中氨態(tài)氮、亞硝酸鹽以及化學(xué)需氧量的含量[10]。本試驗(yàn)與上述試驗(yàn)結(jié)果相似，試驗(yàn)組的氨態(tài)氮、亞硝酸鹽以及化學(xué)需氧量都顯著低于對(duì)照組。其中試驗(yàn)組微藻益生菌制劑對(duì)氨態(tài)氮的移除率為21%～38%，對(duì)亞硝酸鹽的移除率為26%～44%，對(duì)化學(xué)需氧量的移除率為11%～25%。因此微生態(tài)制劑對(duì)牡蠣養(yǎng)殖水質(zhì)起到了很好的凈化效果。

在池塘養(yǎng)殖系統(tǒng)中，氨態(tài)氮、亞硝氮和硝態(tài)氮是氮元素的主要存在形態(tài)，3種形態(tài)通過(guò)微生物的氧化、硝化、反硝化、氨化、固氮等一系列生理活動(dòng)進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化。在這3種形態(tài)中，氨態(tài)氮與亞硝氮的高濃度會(huì)對(duì)魚類、貝類產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用。此外，水中化學(xué)需氧量反映了水體受還原性物質(zhì)污染的程度，而水中還原性物質(zhì)的多少會(huì)對(duì)水生生物的呼吸等生理活動(dòng)產(chǎn)生影響。因此降低水體中氨態(tài)氮、亞硝氮以及化學(xué)需氧量的濃度是改善水質(zhì)重要的技術(shù)措施。王彥波等通過(guò)在養(yǎng)蝦池中加入光合細(xì)菌、芽孢桿菌等微生態(tài)制劑發(fā)現(xiàn)水體氨態(tài)氮、亞硝氮、COD的濃度顯著下降[11]。王芳等在菲律賓蛤仔育苗池中添加一株分離自近岸海水的紫色非硫菌科紅假單胞菌，不僅提高了幼苗的存活率和變態(tài)率，而且還顯著降低了養(yǎng)殖水體中的氨態(tài)氮含量[12]。劉麗等研究了紅假單胞菌和枯草芽孢桿菌對(duì)皺紋盤鮑生長(zhǎng)和免疫指標(biāo)的影響，皺紋盤鮑的成活率、殼長(zhǎng)、殼長(zhǎng)日增長(zhǎng)量和體重分別提高了27.5%、1.46 mm、25 μm、14.06 mg，同時(shí)各項(xiàng)免疫指標(biāo)也有所提高[13]。與上述試驗(yàn)結(jié)果相似，本試驗(yàn)通過(guò)加入微生物制劑將水體中的氨態(tài)氮、亞硝酸鹽和部分有機(jī)物質(zhì)分解成了CO2、硝酸鹽等無(wú)毒物質(zhì)，加入的微藻還能吸收利用氮、磷以及金屬污染物[14-15]。除了凈化水質(zhì)以外，試驗(yàn)組貝類還可以通過(guò)濾食人工培育的微藻和益生菌獲得更多的可以用于生長(zhǎng)的養(yǎng)分。因而試驗(yàn)組的牡蠣增肥率要顯著高于對(duì)照組。endprint

3.2 微藻益生菌對(duì)貝類的凈化

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，廣東沿海海域環(huán)境污染越來(lái)越嚴(yán)重，海水中有害物質(zhì)以及重金屬含量不斷升高。作為一種濾食性底棲動(dòng)物，有害物質(zhì)在雙殼貝類體內(nèi)大量積累，因而通過(guò)測(cè)定它們體內(nèi)重金屬的含量可以方便地指示出水域受重金屬污染的情況[16]。但是貝類是我國(guó)重要的食用海產(chǎn)品，積累在貝類中的重金屬隨著食物鏈會(huì)不斷富集，如果人類食用了重金屬含量超標(biāo)的貝類則會(huì)出現(xiàn)重金屬中毒現(xiàn)象[2]，降低貝類體內(nèi)重金屬含量具有重大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。程華勝在近江牡蠣的重金屬累積和排出試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)近江牡蠣對(duì)重金屬的累積是凈累積型，提高鹽度投喂扁藻、小球藻有利于近江牡蠣重金屬的排除[6]。與上述試驗(yàn)結(jié)果相似，本研究應(yīng)用含微藻及益生菌的生態(tài)制劑顯著降低了試驗(yàn)組近江牡蠣中重金屬等有害物質(zhì)的含量，因而利用微藻及益生菌生態(tài)制劑凈化貝類具有現(xiàn)實(shí)可行性。

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