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        金納米顆粒在食品抗氧化能力評(píng)價(jià)中的檢測(cè)應(yīng)用

        2015-06-15 17:35:59馬滔馬小媛王周平
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年4期
        關(guān)鍵詞:抗氧化能力

        馬滔+馬小媛+王周平

        摘要:選取沒食子酸、咖啡酸、原兒茶酸、阿魏酸、香草酸5種酚酸化合物和康師傅東方樹葉、農(nóng)夫山泉水溶C100這2種茶飲料作為還原劑,誘導(dǎo)金納米顆粒的生長,并利用分光光度計(jì)測(cè)定所形成金納米顆粒的吸光度,以評(píng)價(jià)各試驗(yàn)物質(zhì)的抗氧化能力。結(jié)果表明,5種酚酸化合物抗氧化能力從強(qiáng)到弱依次為沒食子酸>咖啡酸>原兒茶酸>香草酸>阿魏酸;2種茶飲料抗氧化能力從強(qiáng)到弱依次為農(nóng)夫山泉水溶C100>康師傅東方樹葉綠茶。通過與傳統(tǒng)清除2,2-二苯基-1-苦基肼自由基(DPPH·)水平以評(píng)價(jià)抗氧化能力的方法相比,基于金納米材料檢測(cè)抗氧化劑抗氧化能力的方法準(zhǔn)確可靠、操作簡單、響應(yīng)迅速,值得推廣應(yīng)用。

        關(guān)鍵詞:金納米顆粒;抗氧化能力;酚酸化合物;DPPH·

        中圖分類號(hào): TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

        文章編號(hào):1002-1302(2015)04-0282-04

        收稿日期:2014-05-16

        基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(編號(hào):21375049);國家科技支撐計(jì)劃(編號(hào):2012BAK08B01);江蘇省科技支撐計(jì)劃(編號(hào):BE2012614)。

        作者簡介:馬 滔(1992—),女,陜西寶雞人,從事食品安全檢測(cè)研究。E-mail:ch_matao@163.com。

        通信作者:馬小媛(1983—),女,江蘇南京人,博士,副教授,從事食品安全檢測(cè)研究。E-mail:maxy@jiangnan.edu.cn。

        生物體系中的氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激,具有抗氧化能力的物質(zhì)能有效抵御氧化應(yīng)激的有害損傷。食品中的抗氧化劑日益引起人們的關(guān)注,對(duì)飲食中潛在的抗氧化劑及其抗氧化能力實(shí)現(xiàn)簡單、可靠、快速的檢測(cè)變得尤為重要。傳統(tǒng)的抗氧化能力檢測(cè)方法主要包括清除生物體內(nèi)活性氧/活性氮自由基、清除非生物體內(nèi)穩(wěn)定自由基和總還原能力檢測(cè)等,如檢測(cè)ROO·、H2O2、ONOO—清除能力等[1-4],這些檢測(cè)方法大多基于化學(xué)試劑和化學(xué)反應(yīng),在實(shí)際應(yīng)用中存在危害人體健康、破壞生態(tài)環(huán)境等問題而受到諸多限制。隨著納米科技的興起與發(fā)展,納米材料以其特有的物理、化學(xué)性質(zhì)在生物學(xué)、化學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景,納米材料應(yīng)用于食品功能評(píng)價(jià)正快速發(fā)展。Jiang等利用硒化鎘量子點(diǎn)(CdSe QDs)的電化學(xué)發(fā)光效應(yīng)研發(fā)出一種檢測(cè)HO·清除能力的方法[5];Kim等于2005年提出一種利用包埋有辣根過氧化物酶的聚合物小球評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的光學(xué)納米傳感方法[6]。

        酚酸是非常重要的天然抗氧化劑,屬苯丙素類化合物,多為對(duì)羥基苯甲酸和對(duì)羥基苯丙烯酸(肉桂酸)的衍生物,如沒食子酸(C7H6O5)、咖啡酸(C9H8O4)、原兒茶酸(C7H6O)、阿魏酸(C10H10O4)、香草酸(C8H8O4)等,廣泛存在于植物體內(nèi)。研究表明,酚酸類成分具有抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌保肝等多種生物活性。Soobrattee等采用Trolox等價(jià)抗氧化能力、鐵離子還原抗氧化及次氯酸鹽清除能力等抗氧化測(cè)定體系,對(duì)酚酸的抗氧化進(jìn)行評(píng)定,結(jié)果表明,酚酸具有較強(qiáng)的抗氧化能力,是良好的抗氧化劑;對(duì)活性氧自由基具有清除作用,可用DPPH·法定性測(cè)定不同酚酸的抗氧化性能力[7]。

        本研究采用沒食子酸、咖啡酸、原兒茶酸、阿魏酸、香草酸等系列酚酸化合物及東方樹葉綠茶、水溶C100這2種茶飲料誘導(dǎo)金納米生長,利用金納米顆粒獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì),產(chǎn)生規(guī)律性變化的紫外-可見-近紅外吸收峰,根據(jù)吸收峰的變化來比較酚酸化合物及茶飲料的抗氧化能力,并與傳統(tǒng)的清除DPPH·自由基檢測(cè)方法進(jìn)行較,以期建立一種基于金納米材料檢測(cè)抗氧化劑抗氧化能力的方法。

        1 材料與方法

        1.1 主要儀器

        UV-1800PC分光光度計(jì),日本島津公司生產(chǎn);DK-S22電熱恒溫水浴鍋;BS124S分析天平;透射電子顯微鏡(TEM)。

        1.2 試劑與材料

        沒食子酸、咖啡酸、原兒茶酸、阿魏酸、香草酸、十六烷基三甲基溴化銨(C19H42NBr)、氯金酸(HAuCl4)、檸檬酸鈉(C6H5Na3O7)、水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、維生素C(C6H8O6)、2,2-二苯基-1-苦基肼自由基(DPPH·),均購于阿拉丁試劑公司;康師傅東方樹葉綠茶、農(nóng)夫山泉水溶C100,均購于大型超市。

        1.3 維生素C還原納米金顆粒標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)量測(cè)定

        1.3.1 試驗(yàn)原理 維生素C(圖1)能抗壞血病,廣泛存在于新鮮水果蔬菜及許多生物中,作為一種高活性物質(zhì)參與新陳代謝過程,是一種強(qiáng)抗氧化劑,能還原Au(Ⅲ)形成金納米顆粒。由于金納米顆粒大小及形貌的變化,使其局域表面等離激元共振吸收峰產(chǎn)生規(guī)律性變化。因此,可以選擇維生素C作為標(biāo)準(zhǔn)樣劑,并作為當(dāng)量與其他物質(zhì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

        1.3.2 試驗(yàn)步驟 準(zhǔn)確稱取維生素C標(biāo)準(zhǔn)品17.612 g,溶解定容至100 mL,搖勻,配制成1 mol/L維生素C標(biāo)準(zhǔn)液;將標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋成0.000 1、0.001、0.01、0.1、1 mol/L的樣液,分別取0.5 mL樣液,加入到含有100 μL 10 mmol/L AuCl-4、600 μL 3.7 mmol/L CTAB、300 μL 0.2 mmol/L檸檬酸鈉、3.5 mL 0.12 mol/L pH值為 8.0磷酸緩沖液中, 混勻; 45 ℃

        水浴10 min,取出,放至室溫,均質(zhì)后測(cè)定350~700 nm 的紫外吸收光度。

        1.4 酚酸類化合物還原納米金顆粒

        1.4.1 試驗(yàn)原理 酚酸化合物(圖2)由于苯環(huán)上酚羥基的還原性,在溶液中不需要金種子的催化即能還原Au(Ⅲ)形成金納米顆粒,其光學(xué)吸收強(qiáng)度與酚酸類物質(zhì)的抗氧化能力呈正相關(guān)[8]。endprint

        1.4.2 試驗(yàn)步驟 把100 μL 10 mmol/L HAuCl4、600 μL 3.7 mmol/L CTAB和300 μL 0.2 mmol/L檸檬酸鈉連續(xù)加入到3.5 mL 0.12 mol/L 磷酸緩沖液(pH值為 8.0)中,混勻;取0.5 mL 0.01 mol/L試驗(yàn)樣品加入混合液中,45 ℃ 水浴 10 min;將混合物迅速移出,冷卻至室溫,均質(zhì)后測(cè)定350~700 nm的紫外吸光度[9]。以0.5 mL超純水代替0.5 mL待測(cè)樣品作為對(duì)照。

        1.5 DPPH·自由基法測(cè)定酚酸類物質(zhì)抗氧化性

        1.5.1 試驗(yàn)原理 DPPH·是一種商業(yè)化的非常穩(wěn)定的自由基,含苯環(huán)結(jié)構(gòu)(圖3),其乙醇溶液顯紫色,在515 nm處有強(qiáng)烈的光學(xué)吸收,且吸收峰位置相對(duì)穩(wěn)定??寡趸瘎┦且环N常見的自由基清除劑,清除能力基于抗氧化劑結(jié)構(gòu)上的特性,包括羥基中O—H 鍵解離能、抗氧化劑失去電子形成苯氧自由基的鍵共振解離能及芳環(huán)上取代基團(tuán)的空間位阻效應(yīng)。清除化學(xué)反應(yīng)的方程式為:DPPH·+PheOH→DPPHH+[PheO(Ⅰ)、PhO(Ⅱ)、PhO(Ⅲ)…],其中,(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)為不同的共振結(jié)構(gòu),并基于以下理論終止反應(yīng):DPPH·+DPPH·→DPPH-DPPH、DPPH·+PheO·→DPPH-PheO、PheO·+PheO·→PheO-PheO,從而決定各種抗氧化劑清除 DPPH·水平的大小[10]。

        1.5.2 試驗(yàn)步驟 稱取0.004 g DPPH·溶于100 mL無水乙醇中,得0.101 4 mmol/L的DPPH·乙醇溶液;分別取 0.05 mL 不同濃度的抗氧化劑待測(cè)物乙醇溶液加入到 3.95 mL 0.101 4 mmol/L DPPH·乙醇溶液中,用分光光度計(jì)每隔一段時(shí)間檢測(cè)其UV-vis-NIR吸收光譜并記錄,直到反應(yīng)液的吸光度保持相對(duì)穩(wěn)定、不再變化為止。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同濃度維生素C誘導(dǎo)金納米顆粒的生長

        由圖4可見,不同濃度維生素C與氯金酸反應(yīng)后,在500~600 nm處出現(xiàn)強(qiáng)烈的吸收峰,并且隨著濃度的增加,吸收峰強(qiáng)度越來越高,這說明維生素C的抗氧化性能力與吸收峰的峰值有相關(guān)性。維生素C具有較強(qiáng)的還原性,會(huì)誘導(dǎo)氯金酸溶液生成金納米顆粒,并產(chǎn)生特殊光學(xué)效應(yīng)。因待測(cè)液濃度均為0.01 mol/L,所以選擇0.01 mol/L,此時(shí)維生素C誘導(dǎo)生成金納米顆粒的最大吸光度作為標(biāo)準(zhǔn)單位,與其他待測(cè)液進(jìn)行比較(圖5)。

        2.2 不同酚酸化合物誘導(dǎo)納米金的生長

        由圖6可以看出,5種酚酸中,沒食子酸紫外吸收峰強(qiáng)度最大,對(duì)應(yīng)的反應(yīng)溶液顏色也最深,呈深紫紅色,其后依次為咖啡酸、原兒茶酸、香草酸和阿魏酸。在弱堿介質(zhì)下,酚酸形成的相應(yīng)苯氧自由基的親核性會(huì)影響酚酸抗氧化能力,并通過共振或分子內(nèi)氫鍵而穩(wěn)定。羧酸基團(tuán)是常見的吸電子基團(tuán),能通過降低芳香環(huán)的電子密度來穩(wěn)定苯氧自由基;

        —CHCH—COOH 連接在苯環(huán)上,通過共振提高苯氧自由

        基的穩(wěn)定性而提高供氫能力[11]。根據(jù)5種酚酸化合物的結(jié)構(gòu)式可知,沒食子含有3個(gè)酚羥基和1個(gè)羧基,其失電子后結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定;咖啡酸含2個(gè)酚羥基和1個(gè)—CHCH—COOH,原兒茶酸含2個(gè)酚羥基和1個(gè)羧基,其酚羥基數(shù)量均比沒食子酸少,則失氫能力弱于沒食子酸;香草酸和阿魏酸都只含有1個(gè)酚羥基,還原性最弱。把5種酚酸物質(zhì)的最大吸光度與 0.01 mol/L 的維生素C進(jìn)行比對(duì),沒食子酸相當(dāng)于1.12倍維生素C,咖啡酸相當(dāng)于0.76倍維生素C,香草酸相當(dāng)于0456倍維生素C,阿魏酸相當(dāng)于0.313倍維生素C。

        由圖8可見,沒食子酸還原出的金納米顆粒最多,其次是原兒茶酸,最后是阿魏酸。結(jié)合5種酚酸物質(zhì)誘導(dǎo)金納米顆粒的紫外光譜及結(jié)構(gòu)分析,可知5種酚酸物質(zhì)的抗氧化性能依次為:沒食子酸>咖啡酸>原兒茶酸>香草酸>阿魏酸。

        2.3 酚酸化合物對(duì)DPPH·清除能力的評(píng)價(jià)

        由圖9、圖10可見,加入抗氧化待測(cè)物后的最初幾分鐘內(nèi),峰強(qiáng)度迅速降低,峰位置不變,這表明反應(yīng)體系內(nèi) DPPH· 被部分清除,并且清除速率較快;隨著反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行,峰強(qiáng)度降低的速率逐漸減慢,并保持相對(duì)穩(wěn)定的水平。

        以加入反應(yīng)體系的抗氧化劑與DPPH·的相對(duì)量(摩爾比)為橫坐標(biāo),以不同濃度抗氧化劑清除DPPH·后反應(yīng)體系內(nèi)的剩余DPPH·量作為縱坐標(biāo)作曲線(圖11-A);同樣,以加入反應(yīng)體系的抗氧化劑與DPPH·的相對(duì)量(摩爾比)為橫坐標(biāo),以不同濃度抗氧化劑清除DPPH·后反應(yīng)體系達(dá)到穩(wěn)定水平所需要的時(shí)間作為縱坐標(biāo)作曲線(圖11-B)。取剩余量為50%時(shí)的濃度為IC50值,將抗氧化劑濃度為 IC50值時(shí)所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間定義為TIC50,將DPPH·的清除能力定義為AE=1/(IC50TIC50)。AE和1/IC50可反映抗氧化劑清除DPPH·的能力,數(shù)值大小反映酚酸化合物清除DPPH·能力的強(qiáng)弱。

        由表1可見, 沒食子酸清除的DPPH·能力最強(qiáng),其次是咖啡酸、原兒茶酸、水溶C100、東方樹葉綠茶、香草酸,阿魏酸最弱。對(duì)DPPH·自由基清除能力的檢測(cè)作為一種傳統(tǒng)的抗氧化能力檢測(cè)法,被廣泛用于各種抗氧化劑抗氧化能力的表征,其中,DPPH·是一種人工合成、穩(wěn)定的商業(yè)自由基,試驗(yàn)操作簡單、數(shù)據(jù)可靠。試驗(yàn)結(jié)果表明,5種酚酸物質(zhì)對(duì)DPPH·的清除能力與基于GNPs生長過程的納米材料光學(xué)檢測(cè)法所得結(jié)果一致。

        2.4 實(shí)際樣品誘導(dǎo)納米金顆粒生長

        水溶C100中含有維生素C,東方樹葉綠茶中含茶多酚,2種物質(zhì)均能夠誘導(dǎo)金納米顆粒生長。由圖12、圖13可見,以0.01 mol/L的維生素C作為當(dāng)量,水溶C100相當(dāng)于0.587倍

        表1 5種酚酸物質(zhì)和2種茶飲料清除DPPH·自由基的能力endprint

        物質(zhì) IC50 1/IC50 TIC50

        (min) AE

        (mmol/mol) 反應(yīng)情況

        沒食子酸 0.015 66.667 10.2 6 600.667 快,迅速

        咖啡酸 0.126 7.937 13.4 999.938 快,較迅速

        原兒茶酸 0.238 4.200 36.7 114.487 較快,中速

        香草酸 48.439 0.020 6 44.1 0.468 慢,低速

        阿魏酸 76.316 0.013 1 51.4 0.255 慢,低速

        東方樹葉 0.289 3.745 38.8 93.529 較快,中速

        水溶C100 0.267 3.460 37.2 96.016 較快,中速

        維生素C,東方樹葉綠茶相當(dāng)于0.567倍維生素C。由表1可見,根據(jù)AE值,2種茶飲料還原性從強(qiáng)到弱為水溶C100>東方樹葉綠茶。

        3 結(jié)論

        本試驗(yàn)通過不同濃度的維生素C與氯金酸相互作用生成金納米顆粒,采用分光光度法測(cè)定生成金納米顆粒的吸光度,表明抗氧化劑的抗氧化性與吸光度之間存在著正相關(guān)關(guān)系。采用相同的方法,用5種不同的酚酸化合物和2種飲料與氯金酸相互作用,測(cè)定其吸光度,以表征7種不同物質(zhì)的抗氧化能力,結(jié)果表明,酚酸化合物還原能力從強(qiáng)到弱依次為沒食子酸>咖啡酸>原兒茶酸>香草酸>阿魏酸,2種茶飲料抗氧化能力從強(qiáng)到弱依次為水溶C100>東方樹葉綠茶。通過與傳統(tǒng)清除DPPH·水平評(píng)價(jià)抗氧化能力的方法相比,證實(shí)應(yīng)用金納米顆粒測(cè)定抗氧化劑抗氧化能力的方法可靠、準(zhǔn)確、簡單、快速,具有廣闊的實(shí)際應(yīng)用前景。

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