商云霞+朱曉慶+谷新利+李效振+喬海博+賈書紅+張東升

摘要：將300羽雄性良鳳青腳麻雞隨機(jī)分為6組，即對(duì)照組、鹽酸左旋咪唑組、黃芪多糖組、高、中、低劑量一定純度中藥復(fù)方多糖組，每組50羽。分別于8日齡皮下注射生理鹽水及鹽酸左旋咪唑、黃芪多糖和不同劑量的一定純度中藥復(fù)方多糖，連續(xù)7 d，在免疫后8、14、21、35、42 d采血，測(cè)定外周血中紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率、紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率、SOD含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪多糖和一定純度中藥復(fù)方多糖均能顯著升高紅細(xì)胞-C3b花環(huán)率和紅細(xì)胞-IC花環(huán)率，增強(qiáng)SOD活性，最佳純度中藥復(fù)方多糖組免疫效果優(yōu)于黃芪多糖，以中劑量中藥復(fù)方多糖效果最好。

關(guān)鍵詞：雞;中藥復(fù)方多糖;黃芪多糖;鹽酸左旋咪唑;紅細(xì)胞免疫功能;超氧化物歧化酶

中圖分類號(hào)： S858.312.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0214-03

收稿日期：2014-12-17

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30960291）。

作者簡(jiǎn)介：商云霞（1965—），女，新疆奎屯人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病防治。E-mail：shangyunxia@shzu.edu.cn。

中醫(yī)藥與免疫學(xué)的關(guān)系極為密切。我國古代就已認(rèn)識(shí)到疾病的發(fā)生和機(jī)體的抵抗力（免疫力）密切相關(guān)，在世界上最早應(yīng)用免疫學(xué)的方法防治疾病。免疫學(xué)對(duì)中醫(yī)藥的發(fā)展具有極其重要的推動(dòng)作用，在闡明中醫(yī)藥防病、治病機(jī)理，研究中藥有效成分，提高中藥臨床療效等方面都具有十分重要的意義。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)許多中草藥中的多糖成分能通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和抗體生成，增加紅細(xì)胞數(shù)量，升高紅細(xì)胞-C3b花環(huán)率、紅細(xì)胞-IC花環(huán)率及紅細(xì)胞補(bǔ)體受體1（CR1）數(shù)量和活性等方式來提高機(jī)體免疫力，改善機(jī)體免疫狀態(tài)。并且紅細(xì)胞上的多種免疫相關(guān)的物質(zhì)，如超氧化物歧化酶（SOD）、CR1、CR3[1]等分工合作，使紅細(xì)胞具有識(shí)別、黏附、濃縮抗體和清除免疫復(fù)合物、增加LAK細(xì)胞數(shù)量、激活NK細(xì)胞，參與機(jī)體免疫調(diào)控作用[2]。與此同時(shí)，從中草藥提取的粗提物中含有大量雜質(zhì)，影響在應(yīng)用時(shí)的穩(wěn)定性[3]。本研究通過比較已證實(shí)能增強(qiáng)小鼠免疫力的經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂吸附解吸附后得到的對(duì)小鼠免疫增強(qiáng)效果最好的一定純度中藥復(fù)方多糖（cCHMPS）、單味中藥多糖黃芪多糖（APS）、人工合成免疫增強(qiáng)劑鹽酸左旋咪唑（LM）對(duì)雞紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率、紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率和SOD活性的動(dòng)態(tài)變化，為篩選出一定純度中藥復(fù)方多糖的最適免疫增強(qiáng)劑量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

中藥復(fù)方由黨參、山植、熟地、川芎、何首烏、當(dāng)歸等11味中藥組成，各單味藥均購自新疆石河子市醫(yī)藥公司;中藥復(fù)方多糖粗提物是從中藥復(fù)方中采用水提-醇沉法提取。純化后中藥復(fù)方多糖是中藥復(fù)方多糖粗提物經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂吸附解吸附后獲得。多糖含量采用苯酚-硫酸法測(cè)定，純化后中藥復(fù)方多糖的含糖量為77.10%。用滅菌蒸餾水將純化后中藥復(fù)方多糖配制成高、中、低（50、25、12.5 mg/mL）3個(gè)劑量濃度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?黃芪多糖由石河子大學(xué)化工學(xué)院采用水提-醇沉法提取，含糖量為29.42%，用滅菌蒸餾水配制成25 mg/mL的劑量濃度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?鹽酸左旋咪唑注射劑購自上海申亞動(dòng)物保健品有限公司;雞新城疫疫苗（La Sota株和CS2株）購自新疆石河子市八師獸醫(yī)站;凍干補(bǔ)體致敏酵母多糖和未致敏酵母多糖由第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院免疫室提供;雞超氧化物歧化酶試劑盒（ELISA）購自上海藍(lán)基生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物及分組

一定純度中藥復(fù)方多糖組（1）高劑量（cCHMPSH 50 mg/mL）;（2）中劑量（cCHMPSM 25 mg/mL）;（3）低劑量（cCHMPSL 12.5 mg/mL）;（4）黃芪多糖組（25 mg/mL APS）;（5）鹽酸左旋咪唑組50 mg/mL LM唑;（6）生理鹽水組（對(duì)照）。1日齡雄性良鳳青腳麻雞由新疆石河子市某養(yǎng)雞場(chǎng)提供，臨床檢查健康。將試驗(yàn)雞于7日齡時(shí)隨機(jī)分為6組，每組50羽。于8日齡分別皮下注射，0.2 mL/羽，連續(xù)注射7 d。

所有試驗(yàn)雞于7日齡時(shí)用雞新城疫活疫苗（La Sota株）滴鼻、點(diǎn)眼免疫，27日齡用雞新城疫疫苗（CS2株）進(jìn)行二免。

1.3 飼養(yǎng)管理

飼料購自新疆天康飼料廠，0～4周齡，飼料中粗蛋白質(zhì)≥20.0%、粗纖維≤4.5%、鈣0.80%～1.30%、總磷≥060%、食鹽0.30%～0.80%;5～8周齡，飼料中粗蛋白質(zhì)≥19.0%、粗纖維≤5.5%、鈣0.70%～1.20%、總磷≥0.60%、食鹽030%～0.80%。

6組雞采用相同的飼養(yǎng)方法、飼養(yǎng)條件、環(huán)境、飼料品質(zhì)及飼養(yǎng)管理進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率測(cè)定 每組隨機(jī)抽取5羽試驗(yàn)雞，于免疫后8、14、21、28、35、42 d翅靜脈采血0.1 mL，按照文獻(xiàn)[4-6]方法進(jìn)行致敏酵母多糖和紅細(xì)胞懸液的制備，紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)數(shù)的計(jì)數(shù)和紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)百分率的計(jì)算。

1.4.2 紅細(xì)胞IC花環(huán)率測(cè)定 把“1.4.1”節(jié)中的致敏酵母多糖改為酵母多糖，其他操作相同，計(jì)算出紅細(xì)胞IC花環(huán)百分率。

1.4.3 超氧化物歧化酶（SOD）含量測(cè)定 每組隨機(jī)抽取5羽試驗(yàn)雞，于免疫后8 d心臟采血，14、21、28、35、42 d翅靜脈采血，常規(guī)分離血清。用SOD ELISA檢測(cè)試劑盒在酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)D值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算雞SOD的濃度。

1.5 數(shù)據(jù)分析endprint

各項(xiàng)免疫指標(biāo)數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（x±s）表示，用SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅細(xì)胞C3b花環(huán)率的動(dòng)態(tài)變化

不同日齡雛雞紅細(xì)胞C3b受體（RBC-C3b）花環(huán)率測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知，不同處理均能不同程度地提高雞RBC-C3b花環(huán)率。并且首免后8 d，cCHMPSM組、cCHMPSH組RBC-C3b顯著高于對(duì)照組和LM組;首免后14 d，cCHMPSM組極顯著高于對(duì)照組，顯著高于LM組;首免后 21 d，cCHMPSM組極顯著高于對(duì)照組和LM組，顯著高于APS組，cCHMPSH組、cCHMPSL組顯著高于對(duì)照組和LM組;首免后28 d，cCHMPSL組顯著高于對(duì)照組，cCHMPSM組極顯著高于對(duì)照組，顯著高于LM組;首免后35 d，cCHMPSM組極顯著高于對(duì)照組和LM組，顯著高于APS組，cCHMPSH組顯著高于對(duì)照組和LM組;免疫后42 d，APS組極顯著高于對(duì)照組，顯著高于LM組，各劑量cCHMPS組均極顯著高于對(duì)照組和LM組。

表1 不同處理紅細(xì)胞C3b花環(huán)率的動(dòng)態(tài)變化

處理

首免后不同時(shí)間紅細(xì)胞C3b花環(huán)率（%）

8 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d

cCHMPSH 6.63±0.28bA 7.20±0.72abAB 8.03±0.42bcAB 7.90±0.53abcABC 7.80±0.26bcAB 7.43±0.09cC

cCHMPSM 6.70±0.25bA 8.07±0.23bB 8.93±0.32cB 8.63±0.43cBC 8.73±0.66cB 7.77±0.44cC

cCHMPSL 6.23±0.20abA 7.10±0.53abAB 7.90±0.32bcAB 8.17±0.50bcABC 7.60±0.29abcAB 7.33±0.54cC

APS 6.17±0.50abA 7.30±0.53abAB 7.70±0.52abAB 7.90±0.12abcABC 7.37±0.09abAB 7.00±0.06bcBC

LM 5.60±0.32aA 6.30±0.25aB 6.77±0.19aA 7.30±0.47abAB 6.23±0.64aA 5.63±0.12abAB

對(duì)照 5.47±0.23aA 6.07±0.22aA 6.67±0.34aA 6.73±0.33aA 6.30±0.46aA 5.40±0.47aA

注：同列數(shù)據(jù)后小寫、大寫字母不同者分別表示差異顯著（P<0.05）、極顯著（P<0.01）。表2、表3同。

2.2 紅細(xì)胞IC花環(huán)率的動(dòng)態(tài)變化

不同日齡雛雞紅細(xì)胞免疫復(fù)合物（RBC-IC）花環(huán)率測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可知，不同處理均能不同程度地提高雞RBC-IC花環(huán)率。首免后8 d，cCHMPSM組RBC-IC花環(huán)率顯著高于對(duì)照組和LM組;首免后14 d，cCHMPSM組極顯著高于對(duì)照組、LM組和APS組，顯著高于cCHMPSL組;首免后21 d，cCHMPSM組極顯著高于對(duì)照組和LM組，顯著高于APS組，cCHMPSH組和cCHMPSL組極顯著高于對(duì)照組和LM組;首免后28 d，APS組顯著高于對(duì)照組，cCHMPSL組顯著高于對(duì)照組和LM組，cCHMPSM組極顯著高于對(duì)照組和LM組，顯著高于cCHMPSL組和APS組，cCHMPSH組極顯著高于對(duì)照組和LM組;首免后35 d，cCHMPSM組極顯著高于對(duì)照組和LM組，cCHMPSH組顯著高于對(duì)照組;首免后42 d，APS組顯著高于對(duì)照組，cCHMPSL組顯著高于對(duì)照組和LM組，cCHMPSM組極顯著高于對(duì)照組和LM組，cCHMPSH組顯著高于對(duì)照組。

表2 不同處理紅細(xì)胞IC花環(huán)率的動(dòng)態(tài)變化

處理

首免后不同時(shí)間紅細(xì)胞IC花環(huán)率（%）

8 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d

cCHMPSH 8.63±0.35abA 9.53±0.28abcAB 10.63±0.46bcB 10.80±0.32abcABC 9.67±0.43bcAB 8.83±0.38bcAB

cCHMPSM 8.93±0.23bA 10.70±0.46cB 11.10±0.36cB 11.73±0.61cC 10.43±0.33cC 9.87±0.17cC

cCHMPSL 8.47±0.28abA 9.27±0.33abAB 10.33±0.30bcB 10.17±0.23cAB 9.40±0.67abcABC 9.10±0.12ccAB

APS 8.10±0.36abA 8.83±0.52aA 9.67±0.43abAB 9.97±0.47abcABC 9.27±0.19abcABC 8.93±0.35bcAB

LM 7.93±0.33aA 8.53±0.34aA 8.80±0.31aA 8.93±0.43abAB 8.40±0.72abAB 8.03±0.48abAB

對(duì)照 7.77±0.23aA 8.37±0.44aA 8.63±0.24aA 8.67±0.15aA 8.17±0.32aA 7.67±0.39aA

2.3 SOD活性的動(dòng)態(tài)變化

不同日齡雛雞血清中SOD含量結(jié)果見表3。由表3可知，首免后14 d，APS組中SOD含量極顯著高于其他各組，cCHMPSH組顯著高于LM組，cCHMPSM組顯著高于對(duì)照組和LM組;首免后21 d，APS組極顯著高于對(duì)照組、LM組，顯著高于cCHMPSH組和cCHMPSL組，cCHMPSH組、cCHMPSL組顯著高于對(duì)照組和LM組，cCHMPSM組極顯著高于對(duì)照組和LM組;首免后28 d，不同多糖組均極顯著高于對(duì)照組和LM組，cCHMPSM組顯著高于APS組和cCHMPSL組;首免后 35 d，各劑量cCHMPS組極顯著高于其他各組;首免后42 d，各劑量cCHMPS組極顯著高于其他各組，cCHMPSH組和cCHMPSM組顯著高于cCHMPSL組。endprint

3 討論與結(jié)論

3.1 LM、APS和cCHMPS對(duì)雛雞紅細(xì)胞免疫功能的影響

Nelson發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞具有免疫黏附作用[7]后，西方國家隨即對(duì)其進(jìn)行了深入研究。1981年Siegel等在前人研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了紅細(xì)胞的多種免疫功能，提出了“紅細(xì)胞免疫系

表3 不同處理組SOD含量的動(dòng)態(tài)變化

處理

首免后不同時(shí)間SOD含量（pg/mL）

8 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d

cCHMPSH 56.29±2.63aA 67.69±4.34abAB 75.59±4.18bcABC 91.03±2.54bcB 141.27±13.96bB 173.88±8.69cC

cCHMPSM 56.36±2.16aA 68.52±2.88bAB 78.66±2.55cdBC 93.29±3.97cB 154.21±14.59bB 176.22±11.95cC

cCHMPSL 60.64±3.23aA 66.57±2.18abAB 74.40±2.41bcABC 82.75±3.85bB 140.41±10.91bB 144.85±6.82bBC

APS 64.26±4.84aA 82.24±1.79cC 88.66±3.24dC 82.21±4.57bB 77.21±1.77aA 64.48±2.12aA

LM 56.42±2.47aA 57.01±2.65aA 63.62±3.46aA 65.43±2.66aA 67.22±2.36aA 59.32±3.21aA

對(duì)照 54.91±4.15aA 57.92±1.83abAB 59.46±1.97aA 60.73±1.11aA 61.45±1.37aA 59.60±2.70aA

統(tǒng)”的概念[8]，從而更新了人們對(duì)紅細(xì)胞功能的認(rèn)識(shí)，促進(jìn)了紅細(xì)胞免疫研究工作的迅速發(fā)展。眾多研究表明，紅細(xì)胞具有清除循環(huán)免疫復(fù)合物、增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬功能、調(diào)控T淋巴細(xì)胞和淋巴因子、識(shí)別、儲(chǔ)存和提呈抗原等作用[9-10]。紅細(xì)胞的這些免疫功能主要是通過免疫黏附來實(shí)現(xiàn)，紅細(xì)胞膜上的CR1（即C3b受體）是免疫黏附的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此判斷紅細(xì)胞免疫功能的主要指標(biāo)為CR1活性。郭峰在紅細(xì)胞免疫的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究方面取得了許多突破性進(jìn)展，建立了一系列紅細(xì)胞免疫功能的監(jiān)測(cè)方法[5]。目前常用C3b受體花環(huán)試驗(yàn)、紅細(xì)胞免疫復(fù)合物（IC）花環(huán)、血清紅細(xì)胞免疫黏附促進(jìn)因子測(cè)定等方法測(cè)定紅細(xì)胞膜上CR1活性。研究表明，許多中藥復(fù)方制劑和多糖可顯著提高紅細(xì)胞免疫水平[11-13]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高、中、低劑量一定純度中藥復(fù)方多糖、黃芪多糖組與對(duì)照組相比，均能提高雛雞紅細(xì)胞-C3b受體花環(huán)率和紅細(xì)胞-IC受體花環(huán)率，增強(qiáng)紅細(xì)胞膜上C3b活性，并且中劑量一定純度中藥復(fù)方多糖組的效果最佳。而鹽酸左旋咪唑組與對(duì)照組相比無明顯差別，原因可能是鹽酸左旋咪唑具有促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖，增強(qiáng)機(jī)體抗體水平等免疫調(diào)節(jié)作用，而對(duì)紅細(xì)胞無明顯免疫調(diào)節(jié)作用。

3.2 LM、APS和cCHMPS對(duì)雛雞抗氧化能力的影響

動(dòng)物機(jī)體在生命活動(dòng)的氧化代謝過程中不斷產(chǎn)生各種活性氧自由基，它們獨(dú)立存在含有1個(gè)或多個(gè)不成對(duì)電子或分子[14]。正常情況下，機(jī)體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和消除保持著一種動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)該平衡一旦被打破，機(jī)體內(nèi)急劇積累的氧自由基便會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生巨大的破壞作用，使核酸主鍵斷裂、氫鍵破壞、蛋白質(zhì)失活和降解，脂質(zhì)發(fā)生過氧化等[15]，導(dǎo)致細(xì)胞壞死、細(xì)胞程序性死亡、過敏反應(yīng)、癌變或其他病理過程[16]。SOD是活性氧清除反應(yīng)過程中第一個(gè)發(fā)揮作用的抗氧化酶，它能將超氧物陰離子自由基快速歧化為過氧化氫（H2O2）和分子氧，之后H2O2在過氧化氫酶（CAT）、各種過氧化物酶（如APX）和抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)樗头肿友?，在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷過程中具有十分重要的作用[17]。血液中SOD活性的高低可間接反映機(jī)體清除活性氧自由基的能力，用來衡量機(jī)體抗氧化作用的大小。試驗(yàn)證明，植物多糖能通過提高體內(nèi)抗氧化酶活性來發(fā)揮抗氧化作用[18]，左旋咪唑能通過在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物（d）-2-氧-3（-2-硫乙基）-5-苯丙硫咪唑啉（OMPI）與活細(xì)胞內(nèi)的氧化產(chǎn)物結(jié)合，清除活性氧自由基，起到保護(hù)細(xì)胞的作用[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高、中、低劑量一定純度中藥復(fù)方多糖、黃芪多糖與對(duì)照相比，均能顯著提高雛雞血清中SOD含量。表明純化后的中藥復(fù)方多糖和黃芪多糖均具有明顯抗氧化活性，本結(jié)論與徐小芳等報(bào)道的中藥復(fù)方多糖和黃芪多糖均能顯著升高血清中SOD含量，提高雞抗氧化能力的試驗(yàn)結(jié)果[20]一致。而鹽酸左旋咪唑?qū)﹄r雞血清中SOD含量影響不大，可能其抗氧化機(jī)制與代謝產(chǎn)物OMPI有關(guān)，而與提高機(jī)體SOD含量無關(guān)。

本試驗(yàn)通過LM、APS和cCHMPS對(duì)紅細(xì)胞免疫功能和SOD活性的比較，驗(yàn)證了中藥多糖能夠通過增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫黏附力和SOD活性提高機(jī)體抵抗病原的能力?？傮w而言，各劑量一定純度中藥復(fù)方多糖，尤其是中劑量一定純度中藥復(fù)方多糖的免疫增強(qiáng)效果均優(yōu)于黃芪多糖，表明中藥復(fù)方多糖各組分間有協(xié)同增效作用，可大大提高中藥復(fù)方多糖的免疫活性，多糖的生物活性不是劑量越大越好，提高劑量并不能增強(qiáng)其免疫活性。

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