吳紅娟，佟 茵，邱賽紅，丁雯雯

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

鹽酸青藤堿對(duì)雄性大鼠精子質(zhì)量及睪丸組織的影響

吳紅娟，佟 茵，邱賽紅，丁雯雯

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的 考察鹽酸青藤堿對(duì)雄性大鼠精子質(zhì)量、睪丸組織形態(tài)及精子頂體酶、睪丸乳酸脫氫酶活性的影響。方法 SD雄性8周齡大鼠36只，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、鹽酸青藤堿低劑量組（60 mg/kg）、鹽酸青藤堿高劑量組（240 mg/kg），連續(xù)給藥10周。觀察各組大鼠精子密度、活動(dòng)度、畸形率、活精率、精子頂體酶、睪丸乳酸脫氫酶活性以及睪丸組織形態(tài)。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，鹽酸青藤堿使附睪質(zhì)量系數(shù)下降（P＜0.05）；對(duì)大鼠精子密度、畸形率、活動(dòng)度、活精率、精子頂體酶活性無明顯影響（P＞0.05）；高、低劑量升高睪丸乳酸脫氫酶活性的作用均有顯著性（P＜0.01，P＜0.05）；對(duì)睪丸組織形態(tài)無明顯改變。結(jié)論 鹽酸青藤堿在等效量3倍、12倍時(shí)對(duì)精子密度、畸形率、活動(dòng)度、活精率、精子頂體酶、睪丸組織形態(tài)均未見明顯不良影響。

鹽酸青藤堿；精子質(zhì)量；精子頂體酶；乳酸脫氫酶；睪丸組織

鹽酸青藤堿是從中藥青風(fēng)藤中提取的生物堿，是臨床常用的抗風(fēng)濕藥，有抗炎、抑制免疫的作用?；谀行钥咕涌贵w免疫不育的發(fā)病機(jī)制與自身免疫有關(guān)，擬將鹽酸青藤堿用于男性抗精子抗體免疫不育的治療。前期已完成了鹽酸青藤堿對(duì)抗精子抗體免疫不育的有效性研究[1]，為進(jìn)一步考察鹽酸青藤堿的安全性，了解在大劑量用藥的情況下，對(duì)大鼠精子質(zhì)量、睪丸組織形態(tài)及精子頂體酶、睪丸乳酸脫氫酶活性的影響，現(xiàn)將研究?jī)?nèi)容報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 鹽酸青藤堿（編號(hào)T-107017），寶雞永嘉天然植物開發(fā)有限公司。

1.1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性8周齡大鼠36只，體質(zhì)量160～180 g（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0004；動(dòng)物合格證號(hào)HNASLKJ20102942）。

1.1.3 試劑 精子頂體酶活性試劑盒（底物酶法）：天津瑞愛金生物科技有限公司 （批號(hào)111122177）；大鼠乳酸脫氫酶（LDH）活性酶聯(lián)免疫分析試劑盒：美國RD公司（批號(hào)20111106）；甲醛、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、生理鹽水等。

1.1.4 主要儀器 GB204電子分析天平（梅特勒托利多公司）；UV-1750紫外可見分光光度計(jì)（島津公司)；高速冷凍離心機(jī)（BECKMAN COULTER美國)；RT-6000全自動(dòng)酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；血球計(jì)數(shù)板等。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 SD雄性8周齡大鼠36只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、青藤堿低劑量組、青藤堿高劑量組，每組12只。據(jù)參考文獻(xiàn)[2]，本實(shí)驗(yàn)采用等效量的3倍量60 mg/kg作為低劑量，12倍量240 mg/kg作為高劑量，灌胃給藥?？瞻讓?duì)照組給蒸餾水，給藥容積均為10 mL/kg。每天上午9時(shí)灌胃，1次/d，連續(xù)10周。

1.2.2 精子懸液的制備 各組大鼠于末次給藥后24 h用頸椎脫臼法處死，迅速取出睪丸、附睪，用脫脂棉粘去脂肪和殘血，稱質(zhì)量，將左側(cè)附睪放入4 mL生理鹽水中，用眼科剪剪碎，用吸管輕輕吹打5～6次，將其置于 37℃水浴下靜置 10 min，用200 μm尼龍篩網(wǎng)過濾后加生理鹽水至4 mL，制成精子懸液備用。

1.2.3 精子密度及畸形率檢測(cè) 據(jù)文獻(xiàn)[3-4]采用附睪尾精子計(jì)數(shù)法。取 “1.2.2”法制得的精子懸液2 mL，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，對(duì)計(jì)數(shù)板的左上、左下、右上、右下角以及正中間的5個(gè)中方格進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)；對(duì)于壓線的精子，采取數(shù)上不數(shù)下、數(shù)左不數(shù)右的原則。一個(gè)中格精子數(shù)的均值乘以16即為0.1 mm3中精子的總數(shù)，再除以0.1 mm3即得到精子密度。

取1滴精子懸液于干燥潔凈的載玻片上，用4%甲醛溶液固定5 min，均勻推片，于空氣中自然干燥，加1%伊紅溶液1滴染色15 min，蓋上蓋玻片，于光學(xué)高倍鏡（40×）下計(jì)數(shù)200個(gè)完整精子，記錄畸形精子數(shù)，計(jì)算精子畸形率。精子畸形率（%）=畸形精子數(shù)/觀察精子數(shù)×100%。

1.2.4 活精率及精子活動(dòng)度檢測(cè) 取1滴精子懸液于載玻片上，再取1滴1%伊紅溶液與之混勻，蓋上蓋玻片。于光學(xué)高倍鏡（40×）下觀察，活精子為無色，死精子為紅色，計(jì)算活精率。精子活精率（%）=活精子/（活精子+死精子）×100%

取1滴精子懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在光學(xué)高倍鏡下（40×）計(jì)數(shù)5個(gè)視野里的精子數(shù)，據(jù)文獻(xiàn)[5]將精子活動(dòng)分0-Ⅳ級(jí)，并計(jì)算活動(dòng)度。精子活動(dòng)度(%)=(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)／(0+I+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)×100%。

1.2.5 精子頂體酶活性檢測(cè) 采用雙抗體夾心法測(cè)定精子頂體酶活性。取“1.2.2”項(xiàng)制得的精子懸液調(diào)節(jié)精子濃度后，按試劑盒說明書操作檢測(cè)精子頂體酶活性[6]。

1.2.6 睪丸乳酸脫氫酶活性檢測(cè) 按“1.2.2”項(xiàng)取出大鼠左側(cè)睪丸，迅速放入手動(dòng)玻璃勻漿器中，加冰PBS緩沖液4 mL，于冰浴下勻漿，于4℃下4 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書操作檢測(cè)睪丸乳酸脫氫酶含量。

1.2.7 大鼠生殖器官臟器系數(shù)檢測(cè) 按 “1.2.2”項(xiàng)處死大鼠后迅速摘取右側(cè)睪丸、附睪、精囊及前列腺，用脫脂棉粘去脂肪和殘血，稱質(zhì)量。按臟器質(zhì)量（g）/大鼠體質(zhì)量（g）×100%，計(jì)算出臟器系數(shù)。

1.2.8 雄性大鼠睪丸組織形態(tài)檢測(cè) 將 “1.2.7”項(xiàng)摘取的大鼠睪丸和附睪，稱質(zhì)量并記錄后，立刻放入福爾馬林溶液中固定保存，送湖南中醫(yī)藥大學(xué)組織與胚胎實(shí)驗(yàn)室作HE染色，在光鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析計(jì)算。計(jì)量資料以“±s”表示，方差齊者采用單因素方差分析，方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸青藤堿對(duì)雄性大鼠精子密度、精子頂體酶活性的影響

對(duì)大鼠的精子密度的影響表現(xiàn)為：與空白對(duì)照組比較，低劑量的鹽酸青藤堿有顯著提高精子密度的作用（P＜0.01），而高劑量則使精子密度降低（P＞0.05）；兩種劑量的鹽酸青藤堿均對(duì)精子頂體酶活性無明顯影響（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠精子密度、精子頂體酶活性結(jié)果 （±s）

表1 各組大鼠精子密度、精子頂體酶活性結(jié)果 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下表同。

組別空白對(duì)照組青藤堿低劑量組青藤堿高劑量組n 12 10 11精子密度（×106/mL）40.00±6.65 51.52±8.85▲▲38.11±8.64精子頂體酶（μiu/106精子）53.47±19.12 68.00±21.56 52.71±20.58

2.2 鹽酸青藤堿對(duì)雄性大鼠精子畸形率的影響

低、高劑量的鹽酸青藤堿對(duì)大鼠精子的外觀形態(tài)未見明顯不良影響。與空白對(duì)照組比較，畸形率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠精子畸形率及睪丸乳酸脫氫酶活性檢測(cè)結(jié)果（±s）

表2 各組大鼠精子畸形率及睪丸乳酸脫氫酶活性檢測(cè)結(jié)果（±s）

組別空白對(duì)照組青藤堿低劑量組青藤堿高劑量組n 12 11 11畸形率（%）6.90±0.56 7.02±0.59 7.18±0.74 LDH（IU/L）1.66±0.36 2.01±0.36▲▲1.99±0.37▲

2.3 鹽酸青藤堿對(duì)精子活動(dòng)度、活精率的影響

對(duì)各組大鼠的精子活動(dòng)度、精子活精率檢測(cè)結(jié)果顯示，鹽酸青藤堿低、高劑量組與空白對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠精子活動(dòng)度、活精率檢測(cè)結(jié)果 （±s，%）

表3 各組大鼠精子活動(dòng)度、活精率檢測(cè)結(jié)果 （±s，%）

組別空白對(duì)照組青藤堿低劑量組青藤堿高劑量組n 12 9 11精子活動(dòng)度81.42±5.38 85.22±2.29 82.45±8.26活精率74.69±6.46 76.92±8.72 72.47±4.24

2.4 鹽酸青藤堿對(duì)睪丸乳酸脫氫酶活性的影響

與空白對(duì)照組比較，鹽酸青藤堿低劑量使睪丸乳酸脫氫酶活性有顯著性升高（P＜0.01），高劑量則使睪丸乳酸脫氫酶活性有升高（P＜0.05），見表2。

2.5 鹽酸青藤堿對(duì)雄性大鼠生殖器官臟器系數(shù)的影響

鹽酸青藤堿低、高劑量持續(xù)給藥后可降低大鼠附睪質(zhì)量，質(zhì)量系數(shù)與空白對(duì)照組比較均有顯著差異（P＜0.05），但對(duì)睪丸、精囊和前列腺質(zhì)量系數(shù)均無明顯影響（P＞0.05），見表4。

表4 各組大鼠生殖器官臟器質(zhì)量系數(shù)結(jié)果 （±s）

表4 各組大鼠生殖器官臟器質(zhì)量系數(shù)結(jié)果 （±s）

組別空白對(duì)照組青藤堿低劑量組青藤堿高劑量組n 12 9 11睪丸1.17±0.08 1.14±0.19 1.15±0.08附睪0.41±0.03 0.38±0.02▲0.38±0.02▲精囊0.44±0.06 0.45±0.06 0.43±0.06前列腺0.15±0.03 0.16±0.04 0.14±0.03

2.6 鹽酸青藤堿對(duì)雄性大鼠睪丸組織形態(tài)的影響

空白對(duì)照組及鹽酸青藤堿低、高劑量組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)與形態(tài)均未見明顯異常。各組均表現(xiàn)為曲細(xì)精管管壁分層結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，腔內(nèi)有較多成熟精子。精子、精原細(xì)胞發(fā)育正常，成熟精子較多。間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目及發(fā)育未見異常情況。見圖1。

3 討論

雄性動(dòng)物的生殖系統(tǒng)包括睪丸、附睪、輸精管和精囊等器官。睪丸主要由生精小管和睪丸間質(zhì)組成，具有產(chǎn)生精子和分泌雄性激素的雙重功能，若睪丸組織受到損傷，睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)排列紊亂，

圖1 大鼠睪丸HE染色顯微圖

生精細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞會(huì)有脫落現(xiàn)象，精子畸形率升高等，因此睪丸結(jié)構(gòu)和功能的正常與否直接關(guān)系到精子質(zhì)量[7]。精子頂體酶存在于精子頂體以及赤道部膜上，是受精過程中重要的酶，當(dāng)精子穿過放射冠到達(dá)透明帶時(shí)，釋放頂體酶溶蝕透明帶進(jìn)入卵子內(nèi)。精子頂體酶直接反映了精子的活力、質(zhì)量，是判斷男性精子質(zhì)量的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之一[8]。乳酸脫氫酶廣泛存在于機(jī)體各組織中，在睪丸中主要位于睪丸的曲細(xì)精管胞漿內(nèi)，參與能量代謝并與生精上皮的成熟有關(guān)，影響精子的生成、代謝、獲能、活動(dòng)能力和受精過程，其活性可以作為評(píng)價(jià)精子正常與否，以及受精能力好壞的客觀指標(biāo)[9]。

低劑量鹽酸青藤堿能顯著提高雄性大鼠的精子密度，對(duì)精子活動(dòng)度、活精率、畸形率、精子頂體酶活性無影響，對(duì)睪丸乳酸脫氫酶活性有升高作用。高劑量鹽酸青藤堿對(duì)雄性大鼠的生殖器官、精子密度、精子活動(dòng)度、活精率、畸形率、精子頂體酶活性無明顯影響，對(duì)睪丸乳酸脫氫酶活性有升高作用。鹽酸青藤堿低、高劑量組大鼠睪丸組織形態(tài)正常，睪丸曲細(xì)精管管壁分層良好，精子、精原細(xì)胞的發(fā)育及數(shù)目正常，腔內(nèi)的成熟精子較多，間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育良好，未見異?，F(xiàn)象。鹽酸青藤堿對(duì)大鼠附睪質(zhì)量系數(shù)有降低的作用，其機(jī)制尚不明確。以上表明，鹽酸青藤堿在相當(dāng)于臨床等效量3倍、12倍持續(xù)給藥10周后，附睪質(zhì)量系數(shù)有所下降，但對(duì)精子密度、畸形率、活動(dòng)度、活精率、精子頂體酶、睪丸組織形態(tài)均未見明顯不良影響。對(duì)睪丸乳酸脫氫酶活性有一定升高作用。

[1]吳紅娟，彭江寧，邱賽紅，等.鹽酸青藤堿對(duì)抗精子抗體免疫不育大鼠精子質(zhì)量的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（3）：125-128.

[2]陳 曦，王艷龍.青藤堿研究現(xiàn)狀及展望[J].江西中醫(yī)藥，2011，42（338）：69-71.

[3]陳瀅如，舒福政，苑鴻雯，等.雌鼠合籠天數(shù)與受孕率、排栓數(shù)與胎數(shù)相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)觀察[J].國際中醫(yī)中藥雜志，2011，33（1）：25-27.

[4]凌慶枝，敖宗華，許泓瑜，等.六味地黃湯對(duì)雄性大鼠生殖系統(tǒng)的影響[J].中成藥，2004，26（7）：561-564.

[5]劉高峰，胡小梅，王春景，等.氯化鑭對(duì)雄性小鼠精子質(zhì)量及睪丸酶活力的影響[J].四川動(dòng)物，2012，31（3）：471-473.

[6]陳 可，包華瓊，丁 杰，等.精子頂體酶活性與精液常規(guī)檢查參數(shù)關(guān)系分析[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（14）：8-10.

[7]吳培福，曲偉杰，郭愛偉，等.氟致小鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷的觀察[J].畜牧與飼料科學(xué)，2012，31（4）：20-21.

[8]于功昌，王筱芬，劉衍忠.苯并咪唑?qū)Υ笫笊δ芎筒G丸酶活力的影響[J].環(huán)境與健康雜志，2008，25（8）：711-713.

[9]劉雅峰，歐建平，周燦權(quán).精漿/精子乳酸脫氫酶活性與男性不育的相關(guān)性[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2010，18（2）：121-122.

（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Sinomenine Hydrochloride on Sperm quality and Testicular Tissue Morphology in Male Rats

Hong-Juan Wu,Yin Tong,Sai-Hong Qiu,Wen-Wen Ding
(School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicne,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To investigate the effectofsinomenine hydrochloride on sperm quality and testicular tissue morphology,sperm acrosome enzyme and testis lactate dehydrogenase(LDH)activity.Methods 36 male 8-week-old SD ratswere randomly divided into the blank controlgroup,sinomenine hydrochloride low-dose group (60 mg/kg),sinomenine hydrochloride high-dose group(240 mg/kg),continuous medication for10 weeks.The sperm density,mobility,deformity rate,live sperm rate,sperm acrosome enzyme activity,testis LDH activity and testicular tissue form in each group rats were observed.Results Compared with the blank control group,the body weight index of epididymiswasdecreased (P＜0.05);There were no statisticaldifference in sperm density,sperm malformation rate, sperm motility rate,living sperm rate and sperm acrosome enzyme activity(P＞0.05);The LDH activity of testicular tissue in high and low dose sinomenine groupswere obvioussignificant(P＜0.01,P＜0.05)； There were no differencesin each dose group of hydrochloric acid sinomenine on testicular tissue morphology.Conclusion The three times and twelve times equivalent sinomenine hydrochloride didn't show obvious adverse effect on sperm density,malformation rate,motility rate, living sperm rate,sperm acrosome enzyme and testicular tissue morphology.

sinomenine hydrochloride;sperm quality;sperm acrosome enzyme;lactate dehydrogenase;testicular tissue

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.07.004

2015-04-07

長(zhǎng)沙市科技局課題（K09050124-11）。

吳紅娟，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥藥效與藥理的研究。