沈 菁，王 超*，張佳麗，劉 昭，劉 密，嚴(yán) 潔，常小榮，郭禮娜

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)心肌缺血再灌注損傷家兔SOD與線粒體膜電位的影響

沈 菁，王 超*，張佳麗，劉 昭，劉 密，嚴(yán) 潔，常小榮，郭禮娜

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的 研究電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷（MIRI）家兔線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開(kāi)放的影響，及其心肌保護(hù)作用機(jī)制。方法 新西蘭大耳白兔18只隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組，每組6只。采用冠脈結(jié)扎法造模，電針內(nèi)關(guān)組在造模前，給予電針刺激20 min/d，共5 d。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清超氧化物歧化酶（SOD）活性，熒光技術(shù)測(cè)定心肌細(xì)胞線粒體膜電位變化，分光光度法測(cè)定520 nm處線粒體吸光度的變化反映線粒體mPTP的開(kāi)放，原位末端標(biāo)記法測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 與模型組比較，電針組心肌細(xì)胞SOD活力顯著提高，凋亡指數(shù)降低（P＜0.01），線粒體膜電位顯著提高（P＜0.05），線粒體吸光度明顯降低（P＜0.01）。結(jié)論 電針內(nèi)關(guān)穴可以有效改善心肌缺血再灌注損傷，對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。

心肌缺血再灌注損傷；針灸；超氧化物歧化酶；線粒體膜電位；線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔

線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mPTP)開(kāi)放目前被認(rèn)為是心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的關(guān)鍵步驟，雖未完全闡明其機(jī)制，但大量研究已表明MIRI導(dǎo)致mPTP的開(kāi)放，引起線粒體功能障礙，最終引起細(xì)胞損傷和死亡[1]。針灸作為一種特色的非損傷性中醫(yī)治療手段，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)，從而達(dá)到有效的心肌保護(hù)作用，對(duì)心血管疾病的防治有著十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)觀察電針“內(nèi)關(guān)”穴預(yù)處理對(duì)兔MIRI線粒體的影響，為電針“內(nèi)關(guān)”穴對(duì)心肌的保護(hù)作用機(jī)制研究提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大耳白兔18只，體質(zhì)量1.5～2.5 kg，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK湘2011-0012，飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50%～70%。

1.2 主要試劑與設(shè)備

細(xì)胞線粒體分離試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒 （上海碧云天生物公司），TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒（武漢博士德公司）。CRT960熒光分光光度計(jì) （日本日立公司），UV754紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) （上海第三分析儀器廠），ECG-9620P三道自動(dòng)分析心電圖機(jī) （上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司），華佗牌SD-Ⅱ型電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司），DW2000動(dòng)物人工呼吸機(jī)（上海益聯(lián)科教設(shè)備公司）。

1.3 造模方法[2]

兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦（4 mL/kg），全身麻醉后仰臥捆綁固定，將心電圖機(jī)針形導(dǎo)聯(lián)刺于皮下，紅色導(dǎo)聯(lián)連右上肢，黃色導(dǎo)聯(lián)連左上肢，綠色導(dǎo)聯(lián)連左下肢，標(biāo)準(zhǔn)電壓：10 mm/mv，走紙速：50 mm/ s，記錄心電圖。頸部去毛逐層切開(kāi)皮膚組織，暴露氣管，行氣管插管，接人工呼吸機(jī)輔助呼吸。在胸骨正中線左側(cè)旁開(kāi)1～2 cm，第三、四肋處逐層切開(kāi)，暴露心臟，在左冠狀動(dòng)脈前降支上、中1/3交界處穿一根零號(hào)醫(yī)用縫合線，置一硅膠管結(jié)扎冠脈，立即監(jiān)測(cè)心電圖，以左心室前壁發(fā)紺及心電圖ST段抬高為缺血標(biāo)志。阻斷冠脈40 min后，松開(kāi)硅膠管，恢復(fù)冠脈灌流60 min。若結(jié)扎前心電圖異常，則退出實(shí)驗(yàn)，在造模過(guò)程中家兔死亡則視為造模失敗。

1.4 分組及干預(yù)方法

18只新西蘭大耳白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組，每組6只。造模成功后，模型組和假手術(shù)組：每天捆綁家兔20 min，5 d后，全身麻醉，行開(kāi)胸手術(shù)，暴露心臟后，于左冠狀動(dòng)脈前降支上、中1/3交界處穿線靜置 40 min，拔線，繼續(xù)靜置60 min，摘取心臟。電針組：電針刺激雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴，20 min/d，5 d后，其余處理同模型組和假手術(shù)組。

1.5 電針?lè)椒把ㄎ欢ㄎ?/p>

電針雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴，深度約0.5 cm，用平補(bǔ)平瀉手法1 min后，接電針，波形為疏密波，刺激強(qiáng)度以兔雙上肢輕微顫動(dòng)為準(zhǔn)則，穴位接負(fù)極，兔尾部接正極，時(shí)間20 min，1次/d，連續(xù)7 d。穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[3]動(dòng)物常用穴位圖譜，并結(jié)合解剖位置進(jìn)行穴位定位，內(nèi)關(guān)：前壁下1/6折點(diǎn)處內(nèi)側(cè)，橈、尺骨間隙中。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 SOD含量 取家兔頸動(dòng)脈血6 mL，離心分離血清和血漿，取血清，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清SOD活性。

1.6.2 線粒體的提取純化 取家兔心尖部組織50～100 mg，按照試劑盒步驟操作提純線粒體。

1.6.3 線粒體膜電位檢測(cè) 把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色緩沖液(1X)稀釋5倍。5倍稀釋的JC-1染色工作液0.9 mL中加入0.1 mL總蛋白量為10～100 μg純化的線粒體。用熒光分光光度計(jì)：檢測(cè) JC-1單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為490 nm，發(fā)射光設(shè)置為530 nm；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，把激發(fā)光設(shè)置為 525 nm，發(fā)射光設(shè)置為590 nm。

1.6.4 線粒體mPTP開(kāi)放檢測(cè) 將線粒體置于重懸液中行考馬斯亮藍(lán)(BSA)法測(cè)定蛋白含量。取線粒體用腫脹液 （120 mmol/L KCl，20 mmol/L MOPS，10 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L K2HPO4，pH 7.4）稀釋至0.25 g/L的蛋白濃度，于25℃、200 μmol/L的CaCl2作用于線粒體，連續(xù)觀察在520 nm處線粒體吸光度的變化，該變化反映線粒體腫脹程度，提示mPTP的開(kāi)放情況。

1.6.5 原位末端標(biāo)記法測(cè)細(xì)胞凋亡 取左心室缺血區(qū)心肌組織，將其迅速放入含有0.1%DEPC的4%多聚甲醛（0.1 mol/LPBS配置）固定液中固定，每只動(dòng)物觀察2張切片，分別以不加TdT酶者為陰性對(duì)照，以脫氧核糖核酸酶（40 μg/mL）消化的切片為陽(yáng)性對(duì)照。正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡陽(yáng)性心肌細(xì)胞呈棕黃色。每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野（×400）中的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)和總細(xì)胞核數(shù)，各取其平均值，以凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)與總細(xì)胞核數(shù)之比計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 電針內(nèi)關(guān)對(duì)家兔心電圖ST段的影響

模型組、電針組兔心電圖 ST段在結(jié)扎后40 min均明顯升高（P＜0.01），表明造模成功。見(jiàn)表1。

2.2 電針內(nèi)關(guān)對(duì)家兔心肌細(xì)胞SOD活力及凋亡指數(shù)的比較

與假手術(shù)組比較，模型組心肌細(xì)胞SOD活力顯著下降、凋亡指數(shù)顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，電針組心肌細(xì)胞SOD活力顯著提高、凋亡指數(shù)顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表1 家兔不同時(shí)相ST段比較 （n=6，±s）

表1 家兔不同時(shí)相ST段比較 （n=6，±s）

注：與同組結(jié)扎前比較△△P＜0.01，△P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組電針組結(jié)扎前0.021±0.031 0.029±0.018 0.008±0.015結(jié)扎40 min 0.025±0.038 0.208±0.145△△0.131±0.085△△再灌注60 min 0.013±0.023 0.199±0.168△0.113±0.035△

表2 電針內(nèi)關(guān)后家兔心肌細(xì)胞SOD活力及凋亡指數(shù)的比較（n=6，±s）

表2 電針內(nèi)關(guān)后家兔心肌細(xì)胞SOD活力及凋亡指數(shù)的比較（n=6，±s）

注：與假手術(shù)組比較△△P＜0.01，△P＜0.05；與模型組比較※※P＜0.01，※P＜0.05。下表同。

組別假手術(shù)組模型組電針組SOD(U/g) 0.358±0.033 0.093±0.019△△0.320±0.025※※凋亡指數(shù)（%）0.950±0.487 5.193±0.691△△1.467±0.202※※

2.3 電針內(nèi)關(guān)對(duì)家兔線粒體膜電位及線粒體吸光度的影響

與假手術(shù)組比較，模型組線粒體膜電位明顯下降、線粒體吸光度明顯升高（P＜0.01），電針組線粒體膜電位也有下降（P＜0.05）；與模型組比較，電針組線粒體膜電位明顯升高（P＜0.05），線粒體吸光度明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 電針內(nèi)關(guān)對(duì)家兔線粒體膜電位及線粒體吸光度的影響（n=6，±s）

表3 電針內(nèi)關(guān)對(duì)家兔線粒體膜電位及線粒體吸光度的影響（n=6，±s）

組別假手術(shù)組模型組電針組線粒體膜電位(red/green) 0.560±0.017 0.226±0.023△△0.515±0.015△※線粒體吸光度0.022±0.006 0.089±0.015△△0.025±0.006※※

3 結(jié)論

mPTP是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的一組蛋白復(fù)合體，是一種非特異性通道,它在心肌細(xì)胞的生存、 凋亡中扮演著重要角色。 正常生理情況下,mPTP允許相對(duì)分子質(zhì)量＜1.5×103的離子自由通過(guò),通過(guò)氧化磷酸化來(lái)驅(qū)動(dòng)ATP合成酶,維持線粒體膜電位及細(xì)胞內(nèi)外的離子平衡。mPTP開(kāi)放是MIRI的關(guān)鍵步驟。缺血時(shí)，心肌細(xì)胞線粒體缺乏氧供，組織中ATP含量顯著降低，在持續(xù)缺血后低pH值(＜6.5)條件下,mPTP會(huì)維持關(guān)閉狀態(tài)。再灌注2～3 min后，細(xì)胞內(nèi)的pH值就可以升高到正常[4]，mPTP開(kāi)放。再灌注最初幾分鐘造成的損傷比較輕，隨后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，損傷逐漸加重[5-6]。在應(yīng)激狀態(tài)下，mPTP開(kāi)放會(huì)使線粒體內(nèi)膜通透性增加，引起線粒體基質(zhì)滲透壓增高，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)水腫，外膜破裂，細(xì)胞色素C與促凋亡細(xì)胞因子等釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外mPTP開(kāi)放會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，引起線粒體跨膜電位的喪失，耗竭ATP，則會(huì)引起細(xì)胞壞死[7]。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，是心肌內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì),它可對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)心肌細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損心肌細(xì)胞。針灸預(yù)處理可通過(guò)刺激缺血再灌注大鼠使SOD增多而減少其細(xì)胞氧化，從而達(dá)到心肌保護(hù)作用[8]。

本課題組近十年來(lái)，一直在研究電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)大鼠、家兔MIRI的保護(hù)作用及其機(jī)理，結(jié)果證明了[9-12]：電針“內(nèi)關(guān)”穴對(duì)MIRI具有保護(hù)作用，可促進(jìn)缺血再灌注動(dòng)物心電圖ST段、T波的恢復(fù)，亦能促進(jìn)缺血再灌注損傷心肌組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)修復(fù)，明顯抑制缺血再灌注損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡。MIRI，會(huì)引起心肌舒縮功能降低、心律失常等。其發(fā)生機(jī)制目前尚未徹底闡明，但認(rèn)為與自由基的作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和白細(xì)胞的激活有關(guān)。其中線粒體功能障礙在MIRI中起著重要的作用[13]，其機(jī)制包括心肌缺氧使ATP生成減少產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基導(dǎo)致Ca2+超載和mPTP持續(xù)性開(kāi)放[14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)與模型組比較，電針“內(nèi)關(guān)”穴能顯著提高SOD清除心肌內(nèi)過(guò)量的有害氧自由基能力，減輕MIRI；同時(shí)電針內(nèi)關(guān)還能顯著提高線粒體膜電位的穩(wěn)定性，降低線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放，減少心肌細(xì)胞的凋亡和壞死，對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。

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（本文編輯 匡靜之）

Effects of electroacupuncture at Neiguan point on SOD and mitochondrion membrane potential in rabbits with myocardial ischemia-reperfusion injury

Jing Shen,Chao Wang*,Jia-Li Zhang,Zhao Liu,Mi Liu,Jie Yan,Xiao-Rong Chang,Li-Na Guo
(College of Acupuncture and Massage,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To investigate the cardioprotective mechanisms of electroacupuncture(EA)at Neiguan point on the opening of mPTP with in rabbits with myocardial ischemia-reperfusion injury(MIRI).Methods 18 New Zealand rabbits were randomly divided into the sham group,model group and EA group,6 rats in each group.The models were established by ligating the coronary artery.The EA group was given electroacupuncture stimulation pretreatment 20 min every day lasting for 5 days before establishing MIRI model.The serum SOD activity was determined by xanthine oxidase method; The mitochondrial membrane potential tested by fluorescent technique;The opening of mPTP in rats with MIRI was evaluated by determining the absorbance of mitochondrion 520 nm using spectrophotometric method;The apoptosis was determined by TUNEL.Results Compared with the model group,the SOD activity of myocardial cell in the EA group was improved obviously,the apoptotic index was decreased(P＜0.01),the mitochondrial membrane potential was improved dramatically (P＜0.05),the absorbance of mitochondrion was reduced significantly(P＜0.01).Conclusion The EA at Neiguan point could improve the MIRI and showed cardioprotective effects.

MIRI;acupuncture;SOD;mitochondrial membrane potential;mPTP

R246；R542.2

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.07.016

2015－04－20

國(guó)家自然科學(xué)基金課題資助(81072868，81102661)；湖南省科技廳課題（2013sk3086）。

沈 菁，女，博士，講師，研究方向：針灸治病機(jī)理的研究。

*王 超，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，醫(yī)學(xué)碩士，E-mail：592436380@qq.com。