程征宇 王明華 羅榕 祝華 蘇靜

(峨眉山市人民醫(yī)院消化內(nèi)科， 四川 峨眉山 614200)

柴芩承氣湯對(duì)急性壞死性胰腺炎小鼠肺HSP70表達(dá)及肺病理改變的影響*

程征宇 王明華 羅榕 祝華 蘇靜

(峨眉山市人民醫(yī)院消化內(nèi)科， 四川 峨眉山 614200)

目的 探討柴芩承氣湯(Chai Qin Cheng Qi Decoction，CQCQD)對(duì)急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)小鼠肺熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)表達(dá)及肺病理評(píng)分的影響。方法 將30只昆明小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、ANP組及CQCQD組各10只。ANP模型采用8%L-精氨酸溶液腹腔注射，4.0mg·g-1·1h-1×2制作。CQCQD組予以CQCQD制劑0.1ml/10g灌胃，1次/2h，觀察其第6h的肺HSP70表達(dá)及肺病理評(píng)分變化。結(jié)果 ANP組HSP70表達(dá)(0.93±0.03)與對(duì)照組(0.81±0.09)相比較，表達(dá)明顯無明顯改變(P>0.05)，CQCQD組HSP70表達(dá)(1.42±0.21)與ANP組相比較，表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，與對(duì)照組相比較，表達(dá)亦明顯上調(diào)(P<0.01)。ANP組肺病理評(píng)分(3.87±0.83)高于對(duì)照組(2.80 ±0.44，P<0.05)，也高于 CQCQD組(3.00±0.63P<0.05)，對(duì)照組肺病理評(píng)分與CQCQD組相比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 CQCQD可明顯上調(diào)小鼠肺HSP70表達(dá)，能明顯減輕ANP小鼠肺的損傷。

柴芩承氣湯； 急性壞死性胰腺炎； 熱休克蛋白

急性胰腺炎(sacute pancreatitis,AP)20%～30%患者臨床過程兇險(xiǎn)，總體病死率5%～10%[1]。早期常死于全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS) 導(dǎo)致的多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[2.3]，其中肺是最早且最易受累的器官，約1/3重癥急性胰腺炎(sever acute pancreatitis,SAP)病人出現(xiàn)急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷(acute pancreatitis-associated lung injury，APALI)或進(jìn)一步發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)，APALI/ARDS所造成的死亡病例約占SAP病人第一周死亡病例的60%[4]。近年來的臨床實(shí)踐表明柴芩承氣湯(Chai Qin Cheng Qi Decoction，CQCQD)是治療SAP的有效中藥方劑[5。6]，具有通里攻下、破痞除滿、清熱解毒、涼血活血的功效，可以排除胃腸積滯，清除腸道內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素，保護(hù)腸道的機(jī)械和免疫屏障，減少SAP休克的發(fā)生率，減緩ARDS、腎功能衰竭、心功能不全、肝功能不全及腸麻痹持續(xù)時(shí)間，減少手術(shù)中轉(zhuǎn)率，縮短SAP病程[7]。但是，CQCQD減輕APALI具體作用機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀測(cè)ANP小鼠第6h的肺HSP70表達(dá)及肺病理評(píng)分變化。初步探討CQCQD減輕小鼠APALI的作用機(jī)制及具體作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年昆明小鼠30只，雌雄不拘，體質(zhì)量20～25g，四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)：scxk(川)2009-09。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制作 ①ANP模型的制作：健康昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，不禁水。采用8%L-精氨酸溶液(L-arginine，美國sigma公司生產(chǎn)，用生理鹽水配制而成，PH值為7.0) 腹腔注射制作小鼠ANP模型，每次4.0mg·g-1，1h后重復(fù)注射一次，72h后即為造模成功[8]。②假模型的制作：造模前準(zhǔn)備健康昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，不禁水。采用生理鹽水代替8%L-精氨酸溶液，注射方法與ANP模型相同。

1.2.2 柴芩承氣湯方劑的組成：柴胡15g、黃芩15g、厚樸15g、枳實(shí)15g、茵陳蒿15g、梔子20g、生大黃20g(后下)、芒硝20g(沖服) 。柴芩承氣湯煎劑制作 峨眉山市人民醫(yī)院制劑室制作。先將中藥用清水浸泡1h，在用煎藥機(jī)煎1/2h，煎成200ml/劑。

1.2.3 凍干粉的制作：由四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化測(cè)試中心，-70℃制作成凍干粉[26]。凍干粉制劑的配制：實(shí)驗(yàn)前用注射用水按2.4g生藥/ml配制備用。主要試劑：熱休克蛋白-70抗體，從博奧森生物科技公司購買。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)方法 給定種子數(shù)，以SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，將健康30只昆明小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、ANP組、CQCQD組(n=3×10)。對(duì)照組：采用假模型小鼠，背部皮下注射生理鹽水1ml，1次/2h，生理鹽水0.1ml/10g灌胃，1次/2h。于第6h取右肺第2葉肺組織連同部分支氣管，分別做病理檢查，其余肺組織用于檢測(cè)HSP70水平。ANP組：采用ANP模型小鼠，背部皮下注射生理鹽水1ml，1次/2h，生理鹽水0.1ml/10g灌胃，1次/2h。于第6h取右肺第2葉肺組織連同部分支氣管，分別做病理檢查，其余肺組織用于檢測(cè)HSP70水平。CQCQD組：采用ANP模型小鼠，背部皮下注射生理鹽水1ml，1次/2h，CQCQD制劑0.1ml/10g灌胃，1次/2h。于第6h取右肺第2葉肺組織連同部分支氣管，分別做病理檢查，其余肺組織用于檢測(cè)HSP70水平。

1.3 觀察指標(biāo) 小鼠肺HSP70表達(dá)及肺病理評(píng)分。小鼠肺HSP70檢測(cè)采用Western免疫印跡(Western Blot)法。結(jié)果采用HSP70與內(nèi)參照β-actin條帶的灰度比來表示。肺病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)[9]，由同一病理醫(yī)師單盲在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理評(píng)分，每張切片隨機(jī)取10個(gè)高倍視野，每張切片的最后評(píng)分為該10視野評(píng)分的平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組肺HSP70表達(dá)水平比較 ANP組HSP70表達(dá)(0.93±0.03)與對(duì)照組(0.81±0.09) 相比較，表達(dá)無明顯改變(P>0.05)，CQCQD組HSP70表達(dá)(1.42±0.21)與ANP組相比較，表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，與對(duì)照組相比較，表達(dá)亦上調(diào)(P<0.01)。 CQCQD組灰度較對(duì)照組和ANP組有明顯加深、加寬，見圖1。

圖1 各組肺HSP70 Western Blot 電泳圖

Figure 1 Electrophotogram of HSP70 by Western blot

注：A1～A3為對(duì)照組， B1～B3為ANP組， C1～C3為CQCQD組

2.2 各組肺病理評(píng)分比較 ANP組肺病理評(píng)分(3.87±0.83)與對(duì)照組(2.80 ±0.44)相比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，ANP組肺病理評(píng)分與 CQCQD組(3.00±0.63)相比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，對(duì)照組肺病理評(píng)分與CQCQD組相比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3 討論

AP患者20%～30%有臨床經(jīng)過兇險(xiǎn)，總體病死率達(dá)5%～10%。AP病理生理過程中，胰酶的異常激活導(dǎo)致局部細(xì)胞因子的活化，繼而由于炎癥級(jí)聯(lián)“瀑布效應(yīng)”使促炎因子大量產(chǎn)生和釋放，導(dǎo)致體內(nèi)促炎因子和抗炎因子失衡，如發(fā)生SIRS，大量中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向肺部趨化、游走、聚集，釋放一系列細(xì)胞因子及損傷性炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致肺泡上皮、肺微血管內(nèi)皮和肺間質(zhì)的急性彌漫性損傷而發(fā)生APALI。當(dāng)細(xì)胞受到損傷性刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)表達(dá)上調(diào)。HSPs具有多種生物學(xué)功能，可促進(jìn)受損細(xì)胞的自身修復(fù)，對(duì)其起到保護(hù)作用[10]。其中，HSP70是HSPs家族最主要的成員之一，HSP70可以減輕肺部炎癥反應(yīng)、肺組織細(xì)胞凋亡以及肺水腫，改善肺的氧合功能，提高肺組織對(duì)各種損傷的耐受性，對(duì)肺起到保護(hù)作用[11]。

大多數(shù)AP在祖國醫(yī)學(xué)六經(jīng)辨證中屬于陽明腑實(shí)證。在疾病的發(fā)展過程中，因臟腑濕熱蘊(yùn)結(jié)、氣滯血瘀，導(dǎo)致大腸之氣閉塞不通而上逆，肺氣被遏，失其宣肅，出現(xiàn)“喘”、“滿”癥情。中醫(yī)理論認(rèn)為“肺與大腸相表里”，大腸氣機(jī)通暢則肺氣才能得以肅降，因此及早“通里攻下”，恢復(fù)腸道動(dòng)力功能 ，能減輕對(duì)肺部的損傷，緩解肺部“喘”、“滿”癥狀。近年來的臨床實(shí)踐表明柴芩承氣湯是治療SAP的有效中藥方劑[5.6]，其由張仲景《傷寒論》治療陽明腑實(shí)證的經(jīng)典名方“大承氣湯”加柴胡及黃芩組成，具有通里攻下、破痞除滿、清熱解毒、涼血活血的功效，可以排除胃腸積滯，清除腸道內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素，保護(hù)腸道的機(jī)械和免疫屏障，減少SAP休克的發(fā)生率，ARDS、腎功能衰竭、心功能不全、肝功能不全及腸麻痹持續(xù)時(shí)間，減少手術(shù)中轉(zhuǎn)率，縮短SAP病程[7]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CQCQD組HSP70表達(dá)(1.42±0.21)與ANP組(0.93±0.03)相比較，表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，而CQCQD組肺病理評(píng)分(3.00±0.63)低于ANP組 (3.87±0.83，P<0.05)，提示CQCQD能上調(diào)肺HSP70表達(dá)并減輕ANP小鼠肺的損傷。

4 結(jié)論

本文研究結(jié)果提示，CQCQD可上調(diào)小鼠肺HSP70表達(dá)，能明顯減輕ANP小鼠肺的損傷，對(duì)臨床研究具有啟迪意義，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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Effect of Chaiqinchengqi Decoction on expression of lung heat shock protein 70 and lung pathological changes in acute necrotizing pancreatitis mice

CHENG Zhengyu, WANG Minghua, LUO rong,etal

(DepartmentofGastroenterology,ThePeople'sHospitalofEmeishan,Emeishan614200,Sichuan,China)

Objective To investigate Chaiqinchengqi decoction (CQCQD) on expression of lung heat shock protein 70 and lung pathological changes in acute necrotizing pancreatitis(ANP) mice. Methods 30 mice were randomized into control group ANP group and CQCQD group with 10 mice in each group. L-arginine was administered intraperitoneally twice at doses of 4g/kg at intervals of 1 hour to induce the ANP of rats. All the rats in the CQCQD group were administrated the CQCQD at doses of 0.1 ml/10g at intervals of 2 hours. The expression of lung heat shock protein 70 and lung pathological changes were observed.Results The expression of lung HSP70 in CQCQD group was 1.42±0.21 (HSP70/β-actin) while that in the control group and ANP group were 0.81±0.09 (HSP70/β-actin) and 0.93±0.03 (HSP70/β-actin), respectively. The changes of expression of lung HSP70 in CQCQD group was more obvious than that in the ANP group and control group (both,P<0.01). However, there was no significant difference between the ANP group and control group (P>0.05). The pulmonary pathological score in ANP group was 3.87±0.83 while that in the control group and CQCQD group were 2.80±0.44 and 3.00±0.63, respectively. The pulmonary pathological score in ANP group was higher than that in the control group and CQCQD group (both,P<0.05). However, there was no significant difference between the control group and CQCQD group (P>0.05).Conclusion The findings of the study indicate that CQCQD can elevate the expression of lung heat shock protein 70 and reduce the damage of ANP mice lung.

Chaiqinchengqi Decoction; Acute necrotizing pancreatitis; Heat shock protein 70

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014SZ0211)

R 576

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.07.008

2014-11-21; 編輯： 陳舟貴)