王杰 牟界 張文斌 雷文匯

(重慶市中醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 重慶 400011)

利拉魯肽對LPS誘導(dǎo)的小鼠肺泡上皮細(xì)胞SP-A表達(dá)的調(diào)控機制研究*

王杰 牟界 張文斌 雷文匯

(重慶市中醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 重慶 400011)

目的 探討胰高糖素樣肽-1(GLP-1)擬似物利拉魯肽對LPS誘導(dǎo)的小鼠肺泡上皮MLE-12細(xì)胞損傷的保護作用和對肺表面活性蛋白-A(SP-A)的調(diào)節(jié)作用。方法 將小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12細(xì)胞分為三組即對照組(Control組)、利拉魯肽+LPS組 (Lir+LPS組)和LPS組。采用MTT法對不同時間點(0、6、12h和24h) MLE-12細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測。在LPS干預(yù)24h后，采用RT-PCR法和western blot法對MLE-12細(xì)胞SP-A和甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(TTF-1)的mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果 在LPS (0.5μg/ml)干預(yù)后，與未干預(yù)細(xì)胞相比較MLE-12細(xì)胞活性呈時間依賴性降低，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但與LPS組相比較利拉魯肽+LPS組細(xì)胞在6h、12h和24h細(xì)胞活性均較高，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與Control組相比較，在LPS干預(yù)12h后MLE-12細(xì)胞SP-A和TTF-1的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且與利拉魯肽+LPS組細(xì)胞相比較，LPS組細(xì)胞SP-A和TTF-1的mRNA和蛋白表達(dá)下降更加顯著，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 在LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12細(xì)胞損傷狀態(tài)下，GLP-1擬似物利拉魯肽可以通過促進(jìn)TTF-1的表達(dá)上調(diào)SP-A的合成，并對Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生保護作用。

胰高糖素樣肽-1； 利拉魯肽； MLE-12細(xì)胞； 肺表面活性蛋白-A； 甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1

肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant, PS)主要由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞合成與分泌，在維持肺泡的穩(wěn)定性和肺組織順應(yīng)性、調(diào)節(jié)肺泡表面液體平衡以及調(diào)節(jié)肺組織固有免疫和炎癥反應(yīng)過程中扮演著重要的角色[1～4]。研究發(fā)現(xiàn)在急性肺損傷(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)狀態(tài)下PS的合成和表達(dá)明顯降低，并且發(fā)現(xiàn)PS減少程度與ARDS病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[5～7]。同時有研究表明上調(diào)和促進(jìn)PS的表達(dá)可以有效延緩或逆轉(zhuǎn)ARDS的疾病進(jìn)展[8～11]。進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究證實甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1 (thyroid transcription factor, TTF-1)對PS成分SP-A具有重要的調(diào)節(jié)作用[12, 13]。實驗發(fā)現(xiàn)利拉魯肽(liraglutide)作為GLP-1擬似物具有多種生物活性[14～16]。本實驗擬探討在LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12細(xì)胞損傷狀態(tài)下利拉魯肽對細(xì)胞損傷的保護作用和對SP-A的調(diào)節(jié)作用以及相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司；利拉魯肽(諾和力)購買于諾和諾德(中國)制藥有限公司；兔抗鼠SP-A抗體、兔抗鼠TTF-1抗體和兔抗鼠β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司； DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；小牛血清(杭州四季清)；超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞活性檢測 小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12細(xì)胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清(FBS)、100 g/L 青霉素、100 g/L 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5 % CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48 h換液、傳代2次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。MLE-12細(xì)胞分為對照組(Control組)、利拉魯肽+LPS組 (Lir+LPS組)和LPS組。其中對照組細(xì)胞加入PBS；LPS組和Lir+LPS組加入LPS (0.5μg/ml)；Lir+LPS組加入100 nM的利拉魯肽溶液進(jìn)行干預(yù)。使用MTT法對對應(yīng)時間點(0、6、12h和24h) MLE-12細(xì)胞的細(xì)胞活性進(jìn)行檢測，重復(fù)實驗4次。細(xì)胞活性(%)=對應(yīng)時間點(OD干預(yù)組/OD 對照組)×100 (%)[17]。

1.2.2 RT-PCR法細(xì)胞SP-A和TTF-1 mRNA表達(dá)檢測 干預(yù)12h后，按照RT-PCR試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。引物：SP-A正義：5′ GCTCAGCCTT AAGAACATGTGTAAGC-3′，反義：5′-GCCTCATA CTCTTCTCGTTGGG-3′；TTF-1正義：5′-GTGCCG GTCCTAGTCAAAGA-3′，反義：5′-CAGATGGGAT AGGCTGGAGA-3′和β-actin正義：5′-CGAGCGG GCTACAGCTTC-3′，反義：5′-GTCACGCACGATT CCCTCT-3′。按照試劑盒說明書介紹進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴增實驗。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)攝影，Quantity One軟件對目的條帶進(jìn)行掃描分析。用與β-actin PCR產(chǎn)物條帶灰度比值作為SP-A和TTF-1 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.3 Western blot法檢測細(xì)胞中SP-A和TTF-1蛋白表達(dá) 干預(yù)12h后，按試劑盒操作提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗鼠單克隆抗體SP-A (1∶1000)、TTF-1 (1∶1000)和β-actin (1∶2000)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000)，用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法結(jié)果分析 采用MTT法對不同時間點(0、6、12h和24h)的細(xì)胞活性進(jìn)行測定。在LPS (0.5μg/ml)干預(yù)后，與未干預(yù)細(xì)胞相比較MLE-12細(xì)胞活性呈時間依賴性降低，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但與LPS組相比較利拉魯肽+LPS組細(xì)胞在6h、12h和24h細(xì)胞活性均較高，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 MTT比色法測定各時間點MLE-12細(xì)胞活性比較

注：對應(yīng)時間點與對照組相比較①P<0.05，對應(yīng)時間點與LPS組相比較②P<0.05。

2.2 SP-A mRNA和蛋白的表達(dá)水平 在LPS(0.5μg/ml)干預(yù)12h后，對MLE-12細(xì)胞SP-A mRNA和蛋白的表達(dá)水平使用RT-PCR法和western blot法進(jìn)行檢測。與Control組相比較，在LPS干預(yù)12h后MLE-12細(xì)胞SP-A mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且與利拉魯肽+LPS組細(xì)胞相比較，LPS組細(xì)胞SP-A的mRNA和蛋白表達(dá)下降更加顯著，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1和表2。

圖1 MLE-12細(xì)胞SP-A表達(dá)的RT-PCR和western blot結(jié)果

Figure 1 The RT-PCR and western blot results of SP-A in MLE-12 cells

分組SP-AmRNASP-AproteinTTF-1mRNATTF-1protein對照組0.93±0.040.87±0.060.98±0.050.95±0.03Lir+LPS組0.57±0.12①②0.52±0.08①②0.72±0.11①②0.68±0.13①②LPS組0.21±0.06①0.16±0.03①0.22±0.06①0.18±0.08①

注：與對照組相比較①P<0.05，與LPS組相比較②P<0.05

2.3 TTF-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平 在LPS (0.5μg/ml)干預(yù)12h后，對MLE-12細(xì)胞TTF-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平使用RT-PCR法和western blot法進(jìn)行檢測。與Control組相比較，在LPS干預(yù)12h后MLE-12細(xì)胞TTF-1 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；且與利拉魯肽+LPS組細(xì)胞相比較，LPS組細(xì)胞TTF-1的mRNA和蛋白表達(dá)下降更加顯著，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2和表2。

圖2 MLE-12細(xì)胞TTF-1表達(dá)的RT-PCR和western blot結(jié)果

Figure 2 The RT-PCR and western blot results of TTF-1 in MLE-12 cells

3 討論

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是呼吸和危重病醫(yī)學(xué)科的常見疾病，據(jù)流行病學(xué)和臨床研究證實在美國和英國每年新發(fā)病人數(shù)約為19萬人，其死亡率高達(dá)35%～60%[18～21]。目前ARDS被定義為由包括膿毒血癥休克、重癥胰腺炎、重癥肺炎、大面積燒傷和嚴(yán)重骨折等肺內(nèi)和或肺外的多種嚴(yán)重疾病和危重狀態(tài)導(dǎo)致的以肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷為中心的失控的炎癥反應(yīng)[18～21]。肺上皮細(xì)胞保護是ARDS治療的重要環(huán)節(jié)之一。

胰高糖素樣肽-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1) 主要由腸道內(nèi)L細(xì)胞合成和分泌，屬于腸肽類激素(incretin)具有包括調(diào)節(jié)糖脂代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和調(diào)控炎癥反應(yīng)等廣泛的生物活性，利拉魯肽作為GLP-1的擬似物目前已廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的臨床治療[14～16]。研究發(fā)現(xiàn)肺上皮細(xì)胞表面存在GLP-1R的表達(dá)[22]。同時有研究指出GLP-1對內(nèi)毒素(LPS)和卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥反應(yīng)有顯著的抑制作用[22]。同時發(fā)現(xiàn)GLP-1對晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycationend products, AGEs)誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞具有保護作用[23]。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)GLP-1擬似物利拉魯肽呈時間依賴性的改善了LPS誘導(dǎo)狀態(tài)下小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12細(xì)胞活性。該結(jié)果表明在LPS誘導(dǎo)的損傷狀態(tài)下利拉魯肽對小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12細(xì)胞具有保護作用。

肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant, PS)主要由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞合成與分泌，在維持肺泡的穩(wěn)定性和肺組織順應(yīng)性、調(diào)節(jié)肺泡表面液體平衡以及調(diào)節(jié)肺組織固有免疫和炎癥反應(yīng)過程中扮演著重要的角色[1～4]。研究發(fā)現(xiàn)ALI/ARDS時由于PS的合成和分泌明顯下降，以及PS的消耗和丟失明顯增加導(dǎo)致肺組織PS明顯減少[8～11]。PS的減少與ALI/ARDS相關(guān)的肺順應(yīng)性下降、肺泡水腫液體清除障礙和氧合障礙密切相關(guān)[8～11]。PS作為一種大分子聚合物其化學(xué)成分較為復(fù)雜，主要包括括磷脂和蛋白兩部分，其中表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白(surfactant-associated protein, SP)主要由SP-A、SP-B、SP-C和SP-D四組成，其中SP-A含量最豐富[1～4]。SP-A在肺泡中的主要作用是幫助形成具有高度表面活性的管狀髓鞘結(jié)構(gòu)，有助于磷脂降低表面張力維持肺泡的穩(wěn)定性和肺組織的順應(yīng)性[1～4]。研究還認(rèn)為SP-A具有作為ALI/ARDS疾病嚴(yán)重程度指標(biāo)的潛在可能[5～7]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)PS成分的表達(dá)對ALI/ARDS具有保護作用[10,11]。我們使用RT-PCR和western blot法對MLE-12細(xì)胞SP-A的表達(dá)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在LPS干預(yù)12h后，MLE-12細(xì)胞SP-A mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低；但LPS組與利拉魯肽+LPS組細(xì)胞相比較，LPS組細(xì)胞SP-A的mRNA和蛋白表達(dá)下降更加顯著。該結(jié)果表明在LPS誘導(dǎo)的損傷狀態(tài)下利拉魯肽可以有效促進(jìn)小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12細(xì)胞SP-A的表達(dá)。研究表明甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1 (thyroid transcription factor, TTF-1)對SP-A的表達(dá)具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[12,13,24]。Liu D等人研究發(fā)現(xiàn)SP-A啟動子區(qū)域存在TTF-1結(jié)合位點，是SP-A基因的重要調(diào)控因子[24]。本實驗中我們對TTF-1 mRNA和蛋白的表達(dá)使用RT-PCR和western blot進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)在LPS干預(yù)12h后，MLE-12細(xì)胞TTF-1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下降；但LPS組與利拉魯肽+LPS組細(xì)胞相比較，LPS組細(xì)胞TTF-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平下降更加明顯。該結(jié)果表明在LPS誘導(dǎo)的損傷狀態(tài)下利拉魯肽可以有效促進(jìn)小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12細(xì)胞TTF-1的轉(zhuǎn)錄與合成。

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12細(xì)胞損傷狀態(tài)下，GLP-1擬似物利拉魯肽可通過促進(jìn)TTF-1的表達(dá)上調(diào)SP-A的合成，并對Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生保護作用。但利拉魯肽對調(diào)控TTF-1表達(dá)的分子機制仍需進(jìn)一步研究和揭示。

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Liraglutide promotes LPS-induced surfactant protein-A expression by up-regulation of TTF-1 in MLE-12 cells

WANG Jie,MOU Jie,ZHANG Wenbin,etal

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TraditionalChineseMedicalHospitalofChongqing,Chongqing400011)

Objective To explore the value of GLP-1 analogue liraglutide in the regulation of surfactant protein-A (SP-A) expression in LPS-induced injury in type II murine alveolar epithelial MLE-12 cells, and its potential mechanism. Methods MLE-12 cells, a cell line derived from murine type II alveolar epithelial cells, were stimulated with LPS (0.5μg/ml) in the presence and absence of GLP-1 analogue liraglutide. Then, MTT was used to evaluate the cell viabilities at the corresponding time points (0h, 6h, 12h and 24h). After 12 hours of LPS stimulation, the mRNA and protein expression of SP-A and TTF-1 were measured by RT-PCR and western blot. Results The cell viabilities of MLE-12 cells were time-dependent reduced after LPS stimulation. And LPS-reduced MLE-12 cell viabilities were markedly attenuated by liraglutide at each corresponding time points. Then, after 12 hours of LPS stimulation, the mRNA and protein of SP-A and TTF-1 were significantly inhibited by TTF-1. However, LPS-induced down-regulation of SP-A and TTF-1 were largely abrogated by liraglutide in MLE-12 cells. Conclusion Our data suggestes that liraglutide could promotes LPS-induced surfactant protein-A (SP-A) expression possibly through up-regulation of TTF-1 in type II alveolar epithelial MLE-12 cells.

Glucagon-likepeptide1; Liraglutide; MLE-12 cells; Surfactant protein-A; Thyroid transcription factor

重慶市衛(wèi)生和計生委科技項目(ZY201402030)

R 503; R 446.6

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.07.007

2014-11-03； 編輯： 陳舟貴)