于四海 嚴(yán)曉峰

(重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心口腔科， 重慶 400036)

羅格列酮上調(diào)PPARγ抑制舌癌Tca8113細(xì)胞VEGF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

于四海 嚴(yán)曉峰

(重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心口腔科， 重慶 400036)

目的 探討過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)激動(dòng)劑羅格列酮(rosiglitazone)對(duì)于舌癌Tca8113細(xì)胞VEGF表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 方法 將Tca8113細(xì)胞分為對(duì)照組(Control組)、羅格列酮干預(yù)組(ROS組)及羅格列酮+PPARγ抑制劑GW9662組(ROS+GW組)共三組。使用MTT法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)(0、24、72h)的Tca8113細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)；使用western blot法對(duì)干預(yù)24小時(shí)后Tca8113細(xì)胞PPARγ及VEGF的活化水平進(jìn)行分析。結(jié)果 與對(duì)照組相比，羅格列酮干預(yù)的Tca8113細(xì)胞活性呈時(shí)間依賴性下降，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且各時(shí)間點(diǎn)ROS組較ROS+GW組細(xì)胞活性下降程度更加明顯，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)24小時(shí)后，羅格列酮干預(yù)的Tca8113細(xì)胞PPARγ表達(dá)水平顯著增加，VEGF表達(dá)水平顯著降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且ROS組較ROS+GW組細(xì)胞PPARγ表達(dá)增加及VEGF表達(dá)降低更加明顯，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 羅格列酮可以通過上調(diào)PPARγ抑制人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞VEGF表達(dá)，從而抑制Tca8113細(xì)胞的增殖。該實(shí)驗(yàn)為PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮應(yīng)用于腫瘤的臨床治療提供了理論依據(jù)。

Tca8113細(xì)胞； 羅格列酮； 過氧化物酶體增殖物激活受體γ； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

過氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ)屬于核受體PPAR家族，在多種組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，對(duì)多種生理和病理生理過程有重要的調(diào)節(jié)作用[1～5]。早期研究發(fā)現(xiàn)PPARγ在糖代謝和脂代謝中扮演著重要的角色，激活和上調(diào)PPARγ表達(dá)可通過促進(jìn)肌細(xì)胞等的胰島素敏感性和糖轉(zhuǎn)運(yùn)有效的促進(jìn)糖代謝[1～5]。目前研究還發(fā)現(xiàn)PPARγ對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、血管生成和凋亡等過程有重要的調(diào)控作用[1, 6～9]。上調(diào)PPARγ的表達(dá)對(duì)包括肺癌、乳腺癌、宮頸癌和大腸癌等多種腫瘤細(xì)胞有顯著的抑制作用[1,6～9]。本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮(rosiglitazone)對(duì)于人舌癌Tca8113細(xì)胞細(xì)胞增殖以及對(duì)VEGF表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞株從中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫購買；鼠抗人VEGF抗體、鼠抗人PPARγ抗體和鼠抗人β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司；羅格列酮和GW9662(美國Cayman Chemicals公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；小牛血清(杭州四季清)；MTT試劑盒(美國Promega公司)；超純水。其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞活性檢測(cè) 人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清、100 g/L 青霉素、100 g/L 鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5 % CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48 h換液、傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。Tca8113細(xì)胞分為對(duì)照組(Control組)、羅格列酮干預(yù)組(ROS組)及羅格列酮+PPARγ抑制劑GW9662組(ROS+GW組)共三組。其中對(duì)照組細(xì)胞加入PBS；ROS組和ROS+GW組細(xì)胞加入羅格列酮(終濃度25μM)；同時(shí)羅格列酮組加入GW9662 (終濃度10μM)。使用MTT法對(duì)干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)(0、2h和48 h)的細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性(%)=(樣本OD值/對(duì)照組OD值)×100 (%)[1]。

1.2.2 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中VEGF和PPAR-γ蛋白表達(dá) 按照試劑盒操作要求，首先提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入鼠抗人單克隆抗體VEGF (1∶1000)、PPARγ (1∶1000)和β-actin (1∶1500)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000)，用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 11.0進(jìn)行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性分析 使用MTT法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)(0、24和48h)的人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。與Control組相比較，給予羅格列酮干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性均有明顯下降，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且各時(shí)間點(diǎn)ROS組細(xì)胞活性較ROS+GW組降低更明顯，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 VEGF表達(dá)水平分析 干預(yù)24h后，使用western blot法對(duì)Tca8113細(xì)胞VEGF表達(dá)水平進(jìn)行分析。與Control組比較，給予羅格列酮干預(yù)后Tca8113細(xì)胞VEGF表達(dá)水平顯著下降，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)與ROS+GW組細(xì)胞相比較，ROS組VEGF表達(dá)下降更加明顯，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1和表2。

表1 MTT比色法測(cè)定Tca8113細(xì)胞活性

注：對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與Control組比較①P<0.05；對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與ROS組比較，②P<0.05。

圖1 Tca8113細(xì)胞VEGF表達(dá)的western blot結(jié)果

Figure 1 The western blot result of the expression of VEGF in Tca8113 cells

表2 Tca8113細(xì)胞VEGF和PPARγ表達(dá)水平

注：與Control組比較①P<0.05；與ROS組比較②P<0.05

2.3 PPARγ表達(dá)水平分析 干預(yù)24h后，使用western blot法對(duì)Tca8113細(xì)胞PPARγ表達(dá)水平進(jìn)行分析。與Control組比較，給予羅格列酮干預(yù)后Tca8113細(xì)胞PPARγ表達(dá)水平顯著增加，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)與ROS+GW組細(xì)胞相比較，ROS組PPARγ表達(dá)增加更加明顯，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2和表2。

圖2 Tca8113細(xì)胞PPARγ表達(dá)的western blot結(jié)果

Figure 2 The western blot result of the expression of PPARγ in Tca8113 cells

3 討論

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)家族屬于配體激活類核轉(zhuǎn)錄因子超家族(nuclear receptor superfamily)，廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞[1～9]。目前研究證實(shí)PPAR具有3種亞型，即PPARα (NR1C1)、PPARβ/δ (NR1C2)和PPARγ (NR1C3)，其中對(duì)PPARγ研究較為深入[1～9]。目前研究證實(shí)PPARγ作為核轉(zhuǎn)錄因子在包括糖代謝、脂代謝、炎癥反應(yīng)調(diào)控和細(xì)胞凋亡等多種生理和病理過程中扮演著重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)PPARγ對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也有重要的調(diào)控作用[1～9]。PPARγ主要通過蛋白-蛋白相互作用和競(jìng)爭(zhēng)性負(fù)性調(diào)控NF-κB、STAT和AP-1等多個(gè)重要的與腫瘤發(fā)生相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子(TF)，進(jìn)而對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、血管生成、自噬和凋亡等過程起調(diào)節(jié)作用[1～9]。如Li J等人的研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)PPARγ可以有效抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖，并抑制ICAM-1和MMP-9的表達(dá)[10]。Qu Q等發(fā)現(xiàn)上調(diào)PPARγ信號(hào)通路可以有效增加結(jié)腸癌SW480細(xì)胞對(duì)于奧沙利鉑的敏感性[11]。Yan S等證實(shí)PPARγ激動(dòng)劑曲格列酮可以有效地誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞的自噬與凋亡[12]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞使用羅格列酮進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，Tca8113細(xì)胞活性呈時(shí)間依賴性的下降。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)該作用可以被PPARγ拮抗劑GW9662所明顯抑制，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明羅格列酮可以通過PPARγ抑制人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞的增殖過程。

腫瘤血管生成(angiogenesis)在實(shí)體腫瘤的增殖過程中扮演著重要的角色，也是腫瘤增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的先決條件和關(guān)鍵步驟[13,14]。在腫瘤生長(zhǎng)過程中促血管生長(zhǎng)因子和血管生長(zhǎng)抑制因子之間的調(diào)節(jié)失衡是腫瘤組織中血管生成的最重要因素[13,14]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是已知的誘導(dǎo)血管生成的最重要的促血管生成細(xì)胞因子，腫瘤細(xì)胞主要通過旁分泌方式誘導(dǎo)周圍組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和管狀結(jié)構(gòu)的形成，但由于腫瘤組織中多數(shù)血管壁僅有單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成通透性較強(qiáng)，且基底膜不完整，易于腫瘤細(xì)胞的通過和轉(zhuǎn)移[15,16]。抑制腫瘤血管生成已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)和腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。大量研究表明抑制和下調(diào)VEGF分泌及表達(dá)可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[15～18]。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PPARγ對(duì)多種腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)有重要的調(diào)控作用[19,20]。Qin L等人發(fā)現(xiàn)羅格列酮可以通過PI3K/AKT通路抑制前列腺癌PC3細(xì)胞VEGF的表達(dá)[19]。Terrasi M等研究發(fā)現(xiàn)環(huán)格列酮可以有效下調(diào)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞VEGF的分泌[20]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在羅格列酮干預(yù)24小時(shí)后人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞PPARγ表達(dá)水平顯著增加，VEGF表達(dá)水平顯著則降低；而與ROS組相比較，ROS+GW組細(xì)胞PPARγ表達(dá)增加及VEGF表達(dá)降低更加顯著，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PPARγ抑制劑GW9662可以有效的拮抗羅格列酮對(duì)于Tca8113細(xì)胞VEGF的抑制作用，說明羅格列酮可以通過上調(diào)PPARγ的表達(dá)抑制Tca8113細(xì)胞VEGF的分泌。

4 結(jié)論

研究結(jié)果顯示，羅格列酮可能是通過上調(diào)PPARγ的表達(dá)抑制了人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞的增殖和VEGF的分泌，為PPARγ激動(dòng)劑應(yīng)用于舌癌等實(shí)體腫瘤的臨床治療奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

[1]尹鵬,胡君,儲(chǔ)著凌, 等. 替米沙坦通過上調(diào)PPAR-γ促進(jìn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TIMP-1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 西部醫(yī)學(xué)， 2014， 26(02): 160-162.

[2]周琳,饒莉. 過氧化物酶體增殖物激活受體-γ與冠心病炎性過程[J]. 西部醫(yī)學(xué)， 2008， 20(01): 188-190.

[3]何斌,何慶. PPARγ及配體在肺損傷中的作用[J]. 西部醫(yī)學(xué)， 2007， 19(05): 956-958.

[4]李冬梅,楚洪波,馬洪喜. 低劑量硝酸鑭對(duì)糖尿病大鼠血清中過氧化物酶體增殖物激活受體-γ和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4表達(dá)的影響[J]. 環(huán)境與健康雜志， 2013， 30(10): 872-874.

[5]石紹川,張凌,李鈳,等. 吡格列酮對(duì)脂質(zhì)灌注大鼠糖代謝和PPAR-γ表達(dá)的影響[J]. 中國病理生理雜志， 2008， 24(07): 1399-1403.

[6]祝海, 翁博文,徐珞,等. 前列腺癌組織PPAR-γ及其配體表達(dá)和作用機(jī)制的研究[J]. 中華腫瘤防治雜志， 2012，19(11): 840-843.

[7]孫月麗, 吳明瑋,曾昭蕾,等. PPAR-γ抑制劑T0070907對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)， 2010， 31(03):343-349.

[8]Aires V, Brassart B, Carlier A,etal. A role for peroxisome proliferator-activated receptor gamma in resveratrol-induced colon cancer cell apoptosis [J]. Mol Nutr Food Res， 2014， 58(9): 1785-1794.

[9]Zurlo D, Assante G, Moricca S,etal. Cladosporol A, a new peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) ligand, inhibits colorectal cancer cells proliferation through β-catenin/TCF pathway inactivation [J]. Biochim Biophys Acta， 2014， 1840(7): 2361-2372.

[10] Li J, Chen L, Yu P,etal. Telmisartan exerts anti-tumor effects by activating peroxisome proliferator-activated receptor-γ in human lung adenocarcinoma A549 cells [J]. Molecules, 2014, 19(3):2862-2876.

[11] Qu Q, Qu J, Guo Y,etal. Luteolin potentiates the sensitivity of colorectal cancer cell lines to oxaliplatin through the PPARγ/OCTN2 pathway [J]. Anticancer Drugs, 2014, 25(9):1016-1027.

[12] Yan S, Yang X, Chen T,etal. The PPARγ agonist Troglitazone induces autophagy, apoptosis and necroptosis in bladder cancer cells [J]. Cancer Gene Ther, 2014, 21(5): 188-193.

[13] 雷華江, 岳軍,孫紅兵,等. 新輔助化療對(duì)宮頸癌組織中微血管密度表達(dá)的影響[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2011, 23(05): 820-821, 824.

[14] 楊福利, 鄭玲.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與肺癌關(guān)系[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2008, 20(03): 638-639, 642.

[15] 王琦, 梁濤,張更棉,等. 胃癌中ERK-1、VEGF的表達(dá)及相關(guān)性分析[J]. 2013, 25(02): 230-231, 234.

[16] 何愛琴, 李詠,劉繼斌,等. 宮頸癌組織ICAM-1和VEGF表達(dá)與放療敏感相關(guān)性研究[J]. 中華腫瘤防治雜志. 2014; 21(04): 284-288.

[17] Fernández JG, Rodríguez DA, Valenzuela M,etal. Survivin expression promotes VEGF-induced tumor angiogenesis via PI3K/Akt enhanced β-catenin/Tcf-Lef dependent transcription [J]. Mol Cancer, 2014, 13(1):209.

[18] Chen G, Xu X, Zhang L,etal. Blocking autocrine VEGF signaling by sunitinib, an anti-cancer drug, promotes embryonic stem cell self-renewal and somatic cell reprogramming [J]. Cell Res, 2014, 24(9):1121-1136.

[19] Qin L, Ren Y, Chen AM,etal. Peroxisome proliferator-activated receptor γ ligands inhibit VEGF-mediated vasculogenic mimicry of prostate cancer through the AKT signaling pathway [J]. Mol Med Rep, 2014,10(1):276-82.

[20] Terrasi M, Bazan V, Caruso S,etal. Effects of PPARγ agonists on the expression of leptin and vascular endothelial growth factor in breast cancer cells [J]. J Cell Physiol, 2013, 228(6):1368-1374.

Rosiglitazone inhibits VEGF expression by up-regulation of PPARγ in tongue cancer Tca8113 cells

YU Sihai, YANG Xiaofeng

(DepartmentofStomatology,ChongqingPublicHealthMedicalCenter,Chongqing400036)

Objective To explore the effect of rosiglitazone on the expression of VEGF in tongue cancer Tca8113 cells, and its potential mechanism. Methods Tca8113 cells were separated into 3 groups, Control group, Rosiglitazone (ROS) group and Rosiglitazone+GW9662 group (ROS+GW group). The cell viabilities of Tca8113 cells in different time points (0h, 24h and 72h) were measured by MTT. After 24 hours treatments, the expression of PPARγ and VEGF were detected by western blot. Results The cell viabilities of Tca8113 cells were time-dependently inhibited by rosiglitazone administration. Moreover, GW9662 abrogated this value of rosiglitazone. After 24 hours treatments, the expression of PPARγ was significantly increased and the expression of VEGF was largely reduced. Nevertheless, our data also showed that these effects of rosiglitazone were significantly blunted by PPARγ antagonist GW9662 in Tca8113 cells.Conclusions Rosiglitazone could reduce the proliferation and inhibit the expression of VEGF by up-regulation of PPARγ in tongue cancer Tca8113 cells.

Tca8113 cells; Rosiglitazone; PPARγ; VEGF

國家“十二五”科技重大專項(xiàng)課題(2012zx10005-008)

嚴(yán)曉峰，E-mail：yanxiaofeng2015@tom.com

R 739.86

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.07.003

2014-10-10； 編輯： 陳舟貴)