陳旭昕 孟激光 韓志海 劉振千 李泳群 張燕 段蘊鈾

(中國人民解放軍海軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100037)

干擾paralemmin-3表達抑制脂多糖誘導的肺泡上皮細胞的炎性反應*

陳旭昕 孟激光 韓志海 劉振千 李泳群 張燕 段蘊鈾

(中國人民解放軍海軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100037)

目的 探討干擾paralemmin-3(PALM3)表達對脂多糖(LPS)誘導的肺泡上皮A549細胞炎性反應的影響。方法 實驗分為正常細胞組(未轉(zhuǎn)染)、對照轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染control siRNA)及PALM3 siRNA轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染針對PALM3的小干擾核糖核苷酸siRNA)三組；采用Western-blot法測PALM3 蛋白表達水平，檢驗PALM3 siRNA的干擾效率。三組細胞同時給予LPS刺激12 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液和總蛋白， ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中的TNF-α、IL-1β含量，同時用Western-blot法檢測各組細胞中單免疫球蛋白白介素-1受體相關蛋白(SIGIRR)表達水平。結果 特異性siRNA轉(zhuǎn)染后成功干擾了PALM3在A549細胞中的表達；給予LPS刺激后，與正常細胞組及對照轉(zhuǎn)染組相比，PALM3 siRNA轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β水平顯著下降，同時PALM3 siRNA轉(zhuǎn)染組細胞中SIGIRR的表達上調(diào)。結論 干擾PALM3的表達可減輕A549細胞對LPS誘導的炎性反應，其可能機制是通過上調(diào)Toll樣受體/白介素-1受體(TIR)負調(diào)控分子SIGIRR的表達來實現(xiàn)的。

paralemmin-3； 脂多糖； 肺泡上皮細胞； RNA干涉； 炎癥

Paralemmin-3 (PALM3)于1992年由Cornish等首次在非洲爪蛙 (Xenopus laevis)中發(fā)現(xiàn)，被稱為Xlgv7/Xlcaax-1，屬于Paralemmin蛋白家族[1]。研究發(fā)現(xiàn)，PALM3可能與膜蛋白的運輸或靶向有關，可能作為“接頭”分子參與信號轉(zhuǎn)導[2]。同時有研究表明，PALM3在脂多糖 (lipopolysacharride, LPS)刺激后其表達呈上調(diào)趨勢，這一表達模式則類似于接頭分子MyD88、TRIF及病原模式受體TLR4[3]，提示PALM3亦可能是Toll樣受體/白介素-1受體(Toll like receptor/Interleukin-1 receptor, TIR)信號通路中的關鍵分子。因此從上述理論推斷干擾PALM3表達，應能減輕LPS誘導的炎性反應。鑒于此，本實驗擬以小干擾核糖核苷酸(small interfering RNA, siRNA)為介導，干擾PALM3在人肺泡上皮細胞系A549細胞中的表達，觀察PALM3表達下調(diào)后對LPS誘導的A549細胞炎性反應的影響，同時對可能的分子機制進行探討，以期為炎性調(diào)控提供更多實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 A549細胞購自中國科學院上海細胞所。Control siRNA和PALM3 siRNA均購置美國Santacruz公司。Lipofectamine 2000和Opt-MEM 無血清培養(yǎng)基購自美國Invitrogen 公司，LPS(Ecoil0111：B4)購自美國Sigma，高糖RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均為BIBCO公司產(chǎn)品。人TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒購自深圳達科為生物技術公司?？谷薖ALM3抗體為Novus Biologicals公司產(chǎn)品?？谷薙IGIRR抗體及PVDF膜購自美國SantaCruz公司。相對應二抗、抗人GAPDH 抗體、增強型ECL發(fā)光試劑盒、蛋白定量BCA 法試劑盒和細胞總蛋白提取試劑盒均為碧云天生物技術公司產(chǎn)品。其他生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 在37.0℃、5% CO2及95%濕度條件下，將A549細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，隔天換液1次，2～3 d傳代1次。實驗用細胞均處于對數(shù)生長期。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前1 d以3×105/孔接種至24孔板中，待細胞融合為70%時用于實驗。按照Santa Cruz公司的說明書，分別稀釋control siRNA和PALM3 siRNA，然后按照invitrogen公司Lipofectamin2000試劑說明操作，用50 μL Opti-MEM減血清培養(yǎng)基分別稀釋20 pmoL siRNA及1μL Lipofectamin2000然后再將兩者混勻，室溫孵育20min；將上述混合液加入到24孔板的一個孔中，在37℃，5%CO2及95%濕度條件下，培養(yǎng)6 h；更換成含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，備用后續(xù)實驗。

1.2.2 PALM3蛋白表達水平檢測 按上述方法接種轉(zhuǎn)染細胞，共分為正常細胞組、對照轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染control siRNA)和PALM3 siRNA轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染48 h后，用Western blot法檢測PALM3蛋白水平。分別收集各組細胞，用PBS洗滌1次，加入碧云天細胞總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，并按蛋白定量BCA 法試劑盒說明書進行蛋白濃度測定，取總蛋白相等的樣品行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結束后，將PVDF膜取出用5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，與一抗4℃ 孵育過夜，洗膜3次后與辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育2 h，同前洗膜3次后，用增強型ECL發(fā)光試劑盒顯影，曝光顯影掃描后，用LeicaQwin圖像分析軟件進行吸光度積分值分析。

1.2.3 細胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-1β含量檢測 接種及轉(zhuǎn)染細胞操作同前，三組轉(zhuǎn)染 48 h后，加入10 μg/ml的LPS刺激12h后，終止培養(yǎng)收集三組細胞培養(yǎng)上清，用達科為ELISA試劑盒分別檢測TNF-α、IL-1β含量，具體操作參照說明書進行。每個樣本設置3個復孔，檢測結果取平均值。

1.2.4 SIGIRR蛋白表達水平檢測 接種及轉(zhuǎn)染細胞操作同前，三組轉(zhuǎn)染48 h后，棄去原培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌細胞1次后，加入10 μg/ml的LPS刺激12h后終止培養(yǎng)，收集各組細胞，同前操作行Western blot檢測，檢測各組細胞中SIGIRR蛋白表達水平。

2 結果

2.1 PALM3蛋白表達水平 與正常細胞組及對照轉(zhuǎn)染組相比，PALM3 siRNA轉(zhuǎn)染組PALM3條帶的光密度積分值低于前兩組，提示轉(zhuǎn)染PALM3 siRNA后PALM3蛋白表達水平顯著下降，表達被下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組PALM3蛋白表達水平檢測

Figure 1 The PALM3 protein expression levels in different groups

注：與正常細胞組及對照轉(zhuǎn)染組比較，①P<0.05。

2.2 細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β含量 用ELISA法檢測LPS刺激12h后各組細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β含量。結果顯示，與正常細胞組及對照轉(zhuǎn)染組相比，PALM3 siRNA轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)上清中炎性因子TNF-α、IL-1β含量均顯著下降(P<0.05)，見圖2。

圖2 LPS刺激后各組細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β的含量

Figure 2 The levels of TNF-α and IL-1β in the culture supernatants of different groups after LPS-stimulation

注：與正常細胞組及control siRNA轉(zhuǎn)染組比較，①P<0.05

2.3 SIGIRR蛋白表達水平 Western blot結果顯示，與正常細胞組及對照轉(zhuǎn)染組相比，PALM3 siRNA轉(zhuǎn)染組SIGIRR條帶的光密度積分值顯著高于前兩組，提示給予LPS刺激后在PALM3 siRNA轉(zhuǎn)染組A549細胞中SIGIRR蛋白水平較前兩組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 LPS刺激后各組SIGIRR蛋白表達水平檢測

Figure 3 The SIGIRR protein expression levels in different groups after LPS-stimulation

注：與正常細胞組及對照轉(zhuǎn)染組比較，①P<0.05。

3 討論

炎癥失控是ALI/ARDS、急性胰腺炎及炎性腸病等眾多疾病的關鍵機制，調(diào)控炎癥瀑布反應，避免有害和不適宜的炎癥反應是治療ALI/ARDS等炎性疾病的重要策略[4]。Toll樣受體/白介素-1受體(Toll like receptor/Interleukin-1 receptor, TIR)信號通路過度激活是導致炎癥反應爆發(fā)的主要機制之一[5]。下調(diào)此信號通路中“接頭分子”的表達水平，可抑制TIR信號通路過度激活，從而減輕炎性反應并改善ALI/ARDS患者預后。肺泡上皮細胞是ALI/ARDS的發(fā)生發(fā)展重要的靶細胞之一，因此本研究利用RNA干擾技術下調(diào)人肺泡上皮細胞系(A549細胞)中PALM3的表達，研究結果證實下調(diào)PALM3表達減輕了LPS誘導的炎性反應。

PALM3屬于Paralemmin蛋白家族。 Paralemmin蛋白家族可能與細胞質(zhì)膜動力學有關[6～9]。目前對于PALM3的確切功能尚不清楚，有報道顯示，PALM3可能與膜蛋白的運輸或靶向有關，如可作為接頭連接內(nèi)在的膜蛋白分子[2]。PALM3的表達具有細胞特異性，我們前期研究發(fā)現(xiàn)PALM3在人肺泡上皮細胞系(A549細胞)中亦有較高豐度的表達，且LPS刺激后PALM3與MyD88、TRIF及病原模式受體TLR4等TIR信號通路中的信號分子存在類似表達模式[3]。因此推測PALM3亦可能是TIR信號通路中的接頭分子或信號轉(zhuǎn)導的關鍵分子。本研究利用RNA干涉技術下調(diào)了A549細胞中PALM3的表達。經(jīng)過LPS刺激后，PALM3表達下調(diào)組細胞釋放炎性因子顯著減少，提示干擾A549細胞中PALM3表達可以減輕LPS誘導的炎性反應。

單免疫球蛋白白介素-1受體相關蛋白(single immunoglobin IL 1 receptor related protein，SIGIRR)是Toll樣受體/白介素一1受體(Toll like receptor/Interleukin-1，TLR/IL-1)超家族成員之一，屬于TLR/IL-1信號通路中的負性調(diào)控分子[10]。有報道上調(diào)SIGIRR可抑制核轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，減輕內(nèi)毒素(lipopolysacharride, LPS)誘導的炎癥反應[5]。可能的機制是以配體依賴的方式分別與IL-1R或TLR4受體復合物結合，阻礙信號轉(zhuǎn)導從而抑制炎癥反應[11]。

4 結論

本研究結果顯示，下調(diào)PALM3的表達后再給予LPS刺激，SIGIRR在A549細胞中的表達水平較正常細胞組及對照轉(zhuǎn)染組顯著升高，提示下調(diào)PALM3表達而抑制LPS誘導的炎性反應，可能是通過上調(diào)負調(diào)控分子SIGIRR的表達來實現(xiàn)的。目前已有研究顯示，PALM3與SIGIRR之間存在相互作用，但PALM3與SIGIRR之間存在怎樣的“交聯(lián)”對話以及具體的分子調(diào)控機制尚不清楚，仍需進一步深入研究。

[1]Cornish JA, Kloc M, Decker GL,etal. Xlcaax-1 is localized tothe basolateral membrane of kidney tubule and other polarized epithelia during xenopus development [J]. Dev Biol, 1992, 150(1): 108-20.

[2]Hu B, Petrasch-Parwez E, Laue MM,etal. Molecular characterization and immunohistochemical localization of palmdelphin, a cytosolic isoform of the paralemmin protein family implicated in membrane dynamics [J]. Eur J Cell Biol, 2005, 84(11): 853-866.

[3]Chen X, Wu X, Zhao Y,etal. A novel binding protein of single immunoglobulin IL-1 receptor-related molecule: Paralemmin-3 [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 404 (4): 1029-1033.

[4]Liew FY, Xu D, Brint EK,etal. Negativeregulation of Toll-like receptor-mediated immune responses [J]. Nat Rev Immunol, 2005, 5(6): 446-458.

[5]Chen X，Zhao Y, Wu X,etal. Enhanced expression of single immunoglobulin IL-1 recepter-related molecule ameliorates Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice [J]. Shock, 2011, 35(2): 198-204.

[6]Kutzleb C, Sanders G, Yamamoto R,etal. Paralemmin, a prenyl-palmitoyl-anchored phosphoprotein abundant in neurons and implicated in plasma membrane dynamics and cell process formation [J]. J Cell Biol, 1998, 143(3): 795-813.

[7]Basile M, Lin R, Kabbani N,etal. Paralemmin interacts with d3 dopamine receptors: Implications for membrane localization and camp signaling [J]. Arch Biochem Biophys, 2006, 446(1): 60-68.

[8]Bagchi M, Katar M, Lo WK,etal. Paralemnin of the lens [J]. J Cell Biochem, 2003, 89(5): 917-921.

[9]Hu B, Copeland NG, Gilbert DJ,etal. The paralemmin protein family: Identification of paralemmin-2, an isoform differentially spliced to akap2/akap-kl, and of palmdelphin, a more distant cytosolic relative [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 285(5): 1369-1376.

[10] Wald D，Qin J，Zhao Z，etal. SIGIRR，a negative regular of Toll like receptor interleukin 1 receptor signaling [J]．Nat Imm unol, 2003, 4(9)：920-927.

[11] Qin JZ, Qian YC, Yao JH,etal. SIGIRR Inhibits Inerleukin-1 Receptor and Toll-like receptor4-mediated Signaling through Different Mechanisms [J]. J Bio Chem, 2005, 280(26): 25233-25241.

Downregulation of PALM3 expression inhibits the inflammatory reaction induced by LPS in alveolar epithelial cells

CHEN Xuxin,Meng Jiguang，HAN Zhihan，etal

(DepartmentofRespiratory,NavyGeneralHospitalofPLA,Beijing100037,China)

Objective To explore the effect of downregulation of paralemmin-3 (PALM3) expression on the LPS-induced inflammatory reaction in alveolar epithelial cells(A549 cells). Methods The A549 cells were divided into three groups (PALM3 siRNA group, control group and normal group). In PALM3 siRNA group, the expression of PALM3 was down-regulated by PALM3 siRNA in A549 cells; in control group, the cells were transfected with the control siRNA and any intervention was not administered in normal group. At 48h after transfection, the protein expression levels of PALM3 in A549 cells were determined by Western-blot analysis. LPS was given to the cell culture medium after transfection. The culture supernatant and cellular total protein were collected at 12 h after LPS-stimulation. The levels of TNF-α and IL-1β were detected by ELISA. The protein expression levels of SIGIRR were also measured by Western-blot analysis. Results The expression of PALM3 was successfully suppressed by PALM3 siRNA. Compared with control and normal groups, downregulation of PALM3 expression could significantly decrease the release of TNF-α and IL-1β in A549 cells after LPS-stimulation. And, the protein levels of SIGIRR were significantly upregulated after LPS-stimulaition in PALM3 siRNA group. Conclusion Downregulation of PALM3 expression could attenuate the LPS-induced inflammation in alveolar epithelial cells. Upregulation of SIGIRR protein expression may be one of the possible mechanisms.

Paralemmin-3； Lipopolysacharride; Alveolar epithelial cell; Small interfering RNA; Inflammation

國家自然科學基金(81300050)；海軍總醫(yī)院創(chuàng)新培養(yǎng)基金(CXPY201417)

韓志海，醫(yī)學博士，碩士生導師，E-mail：hzhngh@sina.com

R 563.9

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.07.002

2014-11-17； 編輯： 陳舟貴)