文 / 康克龍 何守貴 李曉鵬 文鵬程 趙保堂 張衛(wèi)兵

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州，730070；甘肅嘉泰信息科技有限公司，甘肅蘭州，730030）

牦牛血紅細(xì)胞超聲破碎條件優(yōu)化

文 / 康克龍 何守貴 李曉鵬 文鵬程 趙保堂 張衛(wèi)兵*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州，730070；甘肅嘉泰信息科技有限公司，甘肅蘭州，730030）

為了提高牦牛血紅細(xì)胞破碎率，采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以新鮮的牦牛血為原料，對(duì)影響血紅細(xì)胞破碎率的破碎功率、破碎時(shí)間、血細(xì)胞濃度、破碎時(shí)間間隔四個(gè)單因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果最佳超聲破碎條件表明：超聲破碎紅血細(xì)胞的最優(yōu)條件是破碎功率為200W、破碎時(shí)間為15min、血細(xì)胞濃度為5:1、時(shí)間間隔為6/9，破碎率達(dá)到65.23%。

牦牛；血細(xì)胞；破碎

血紅素是由一個(gè)二價(jià)鐵離子鑲嵌在一個(gè)原卟啉環(huán)而構(gòu)成的稱(chēng)為鐵卟啉的化合物，主要存在于動(dòng)物的血液和肌肉中，是動(dòng)物血液中的天然色素，具有重要的生理功能和很高的實(shí)用價(jià)值，在醫(yī)藥、食品、化工、保健品等行業(yè)中有廣泛的應(yīng)用。動(dòng)物血液是提取血紅素的優(yōu)質(zhì)來(lái)源[1-3]。血紅素主要存在于血液的紅細(xì)胞內(nèi)，紅細(xì)胞經(jīng)過(guò)破碎才能提取到血紅素[7-9]。目前，常用的細(xì)胞破碎方法有高速勻漿法、酶溶法、化學(xué)滲透法等，但是大多存在處理時(shí)間長(zhǎng)、易造成產(chǎn)物抑制、胞內(nèi)物質(zhì)釋放率低、化學(xué)毒性較強(qiáng)等缺點(diǎn)[10-12]。超聲破碎操作簡(jiǎn)單，液量損失少，采用此方法不但降低了生產(chǎn)成本和生產(chǎn)周期，而且還避免了使用對(duì)環(huán)境有污染的氯仿和吡啶等溶劑。

我國(guó)牦牛數(shù)量多，牦牛血資源豐富，并且牦牛血液中血紅蛋白(Hb)含量很高，從牦牛血液中提取血紅素，原料獨(dú)特豐富，成本較低，同時(shí)能夠產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[4-6]。本試驗(yàn)以新鮮牦牛血原料，研究超聲破碎功率、時(shí)間、細(xì)胞濃度和時(shí)間間隔等因素對(duì)破碎牦牛血紅細(xì)胞的影響，尋找最佳的牦牛血紅細(xì)胞破碎工藝參數(shù)，以提高紅細(xì)胞破碎率。

1 、材料與儀器

1.1 原料和試劑

原料：牦牛血，康美現(xiàn)代農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)集團(tuán)公司提供。

試劑：冰醋酸、氯化鈉、丙酮、無(wú)水乙醇、氯仿、NaOH、HCl等。

1.2 試驗(yàn)儀器

電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司），高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（TGL-20MC，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司），小型高速粉碎器（XHF-D，寧波新芝生物科技股份有限公司），超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（Scient2-IID，寧波新芝生物科技股份有限公司），生物顯微鏡（DYS-328，上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司），血球計(jì)數(shù)板，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)），循環(huán)水真空泵（SAI-III，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

新鮮牦牛血液→離心→稀釋→超聲破碎→檢測(cè)破碎率

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 細(xì)胞濃度對(duì)超聲破碎效果的影響

調(diào)整血細(xì)胞濃度為3:1、4:1、5:1、6:1、7:1，設(shè)定超聲波功率為200W，時(shí)間間隔為6/9，破碎15min，超聲破碎后測(cè)定破碎率，考察細(xì)胞濃度對(duì)超聲破碎效果的影響。

1.3.2.2 超聲破碎時(shí)間對(duì)超聲破碎效果的影響

將破碎儀的工作時(shí)間分別設(shè)定為5、10、15、20、25 min，調(diào)整血細(xì)胞濃度為5:1，設(shè)置功率為200W，時(shí)間間隔為6/9時(shí)，超聲破碎后測(cè)定破碎率，考察破碎時(shí)間對(duì)超聲破碎效果的影響。

1.3.2.3 超聲破碎功率對(duì)超聲破碎效果的影響

破碎儀功率分別設(shè)定為100W、150W、200W、250W、300W，調(diào)整血細(xì)胞濃度5:1，設(shè)置時(shí)間間隔為6/9，破碎15min，超聲破碎后測(cè)定破碎率，研究破碎功率對(duì)超聲破碎效果的影響。

1.3.2.4 超聲破碎時(shí)間間隔對(duì)超聲破碎效果的影響

將時(shí)間間隔設(shè)置為2/9、4/9、6/9、8/9，調(diào)整血細(xì)胞濃度為5:1，破碎功率設(shè)定為200W，破碎15min，超聲破碎后測(cè)定破碎率，研究時(shí)間間隔對(duì)超聲破碎效果的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇破碎時(shí)間、破碎功率、血細(xì)胞濃度、時(shí)間間隔4個(gè)影響血細(xì)胞破碎率的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，研究上述因素的綜合效果。

1.3.4 破碎率的測(cè)定[13]

將超聲破碎前后的細(xì)胞懸液分別稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后，在顯微鏡下觀(guān)察，用血球計(jì)數(shù)板對(duì)完整形態(tài)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞破碎率，每組統(tǒng)計(jì)3次取平均值。

式中：A1為破碎前的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果；A2為破碎后的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。

2 、結(jié)果分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 血細(xì)胞濃度對(duì)血細(xì)胞破碎率的影響

圖1 不同血細(xì)胞濃度對(duì)細(xì)胞破碎率的影響

細(xì)胞濃度影響著懸浮液的流變特性，從而會(huì)影響細(xì)胞破碎率。由圖1可以看紅細(xì)胞濃度較高或較低都不利于細(xì)胞破碎。當(dāng)V水:V血細(xì)胞為3:1時(shí)，細(xì)胞的破碎率為46.67%。隨著水添加量的增加細(xì)胞破碎率逐漸升高，當(dāng)V水:V血細(xì)胞為5:1時(shí)，細(xì)胞破碎率達(dá)到最大，為60.67%。而后隨著水添加量的繼續(xù)增加，細(xì)胞破碎率反而開(kāi)始緩慢下降。當(dāng)V水:V血細(xì)胞為7:1時(shí)，細(xì)胞破碎率為55%。因此，選擇紅細(xì)胞的最佳濃度是V水:V血細(xì)胞為5:1。這是因?yàn)榧?xì)胞濃度直接影響溶液的度，從而影響超聲波在液體中的空化效應(yīng)。溶液稠度越大，不利于空化泡的形成及其膨脹的作用，影響破碎效果[14]。

2.1.2 超聲破碎時(shí)間對(duì)血細(xì)胞破碎率的影響

圖2 不同超聲破碎時(shí)間對(duì)血細(xì)胞破碎率的影響

破碎時(shí)間也是影響細(xì)胞破碎率重要因素之一。由圖2可以看出，當(dāng)細(xì)胞破碎時(shí)間為5min時(shí)，細(xì)胞破碎率只有34%。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞破碎率迅速增加，當(dāng)破碎時(shí)間為15min時(shí)，細(xì)胞破碎率達(dá)到了46.33%。而后隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，破碎率開(kāi)始緩慢增加，當(dāng)破碎時(shí)間為25min時(shí)，細(xì)胞破碎率為48.86%。主要原因是超聲破碎時(shí)間過(guò)短，不能有效地破壞紅細(xì)胞細(xì)胞壁，破碎時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)使破碎過(guò)程中產(chǎn)生更多的熱，使得溶液液出現(xiàn)泡沫，并且由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)細(xì)胞過(guò)于破碎，導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)被提取出來(lái)，增加后續(xù)提取分離的難度[15]。因此，選擇15min為最佳細(xì)胞破碎時(shí)間。

2.1.3 超聲破碎功率對(duì)血細(xì)胞破碎率的影響

超聲破碎輸出功率反映了超聲波能量的大小，也是影響細(xì)胞破碎率的重要因素。超聲破碎功率過(guò)小會(huì)造成細(xì)胞破碎率低，破碎不完全，輸出功率的增大有利于液體中空穴的形成，但是輸出功率過(guò)大，由于超聲波處理空化作用引起的細(xì)胞液局部的高溫高壓，會(huì)引起樣品飛濺或產(chǎn)生泡沫[16]。由圖3可以看出，超聲破碎功率對(duì)細(xì)胞破碎率有很大的影響, 輸出功率的增大有利于液體中空穴的形成,產(chǎn)生更多的空化泡，使破碎作用增強(qiáng)。當(dāng)破碎功率由100W升高到200W時(shí)，細(xì)胞破碎由31.33%迅速的增加到了46%。但當(dāng)功率提高至200W以后時(shí)，破碎率增加趨勢(shì)很小，因此將200W確定為最佳破碎功率。

圖3 不同超聲破碎功率對(duì)血細(xì)胞破碎率的影響

2.1.4 超聲破碎時(shí)間間隔對(duì)血細(xì)胞破碎率的影響

圖4 不同超聲破碎時(shí)間間隔對(duì)血細(xì)胞破碎率的影響

工作時(shí)間／間歇時(shí)間是超聲破碎過(guò)程中的重要因素之一，其直接影響細(xì)胞破碎率，而且不同時(shí)間間隔還會(huì)引起超聲破碎過(guò)程中熱效應(yīng)和空化效應(yīng)的改變[16]。由圖4可以看出，當(dāng)超聲時(shí)間為2s時(shí)，細(xì)胞破碎率為36.67%。之后隨著工作時(shí)間的增加細(xì)胞破碎率迅速增加，當(dāng)工作時(shí)間為6s時(shí)，細(xì)胞破碎率增加到了57%。再隨著工作時(shí)間增加到8s時(shí)，細(xì)胞破碎率反而下降為54.67%。原因是采用短時(shí)多次超聲波輻射的工作方式有利于細(xì)胞破碎，而延長(zhǎng)每次超聲波輻射時(shí)間、減少輻射次數(shù)的工作方式使破碎率明顯降低。超聲波通過(guò)空化效應(yīng)破碎細(xì)胞的過(guò)程實(shí)際就是空化泡形成、振動(dòng)、膨脹、壓縮和崩潰閉合的過(guò)程，這一過(guò)程需要一段短暫的時(shí)間來(lái)完成，短時(shí)多次的工作方式能使超聲波產(chǎn)生的空化泡，有足夠的時(shí)間和更多機(jī)會(huì)完成膨脹和爆炸過(guò)程, 因此有利于細(xì)胞的破碎[17]。因此，選擇工作時(shí)間／間歇時(shí)間為6/9是最佳條件破碎時(shí)間間隔。

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇血細(xì)胞濃度、超聲破碎時(shí)間、功率和時(shí)間間隔4個(gè)影響血細(xì)胞破碎率的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1L9( 34)正交試驗(yàn)因素水平表Table1Orthogonal layout of factors and number of level L9( 34)

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2The result analyses of orthogonal experiment

從極差分析可知，破碎時(shí)間（A）、破碎功率（B）、血細(xì)胞濃度（C）、時(shí)間間隔（D）四因素對(duì)血細(xì)胞破碎率的影響大小為A>D>C>B，最佳超聲波破碎血細(xì)胞的組合為A2B3C1D3，即破碎時(shí)間為15min、破碎功率為200W、血細(xì)胞5:1、時(shí)間間隔6/9為血細(xì)胞破碎的最佳條件，即破碎率達(dá)到65.23%。

選取最佳組合A2B3C1D3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次重復(fù)試驗(yàn)的平均破碎率為66.12%，與正交試驗(yàn)的破碎率差異不顯著。

3 、結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)血細(xì)胞濃度、破碎功率、破碎時(shí)間、時(shí)間間隔四個(gè)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)及其驗(yàn)證試驗(yàn)確定出最佳細(xì)胞破碎條件為:血細(xì)胞濃度5:1、破碎功率200W、破碎時(shí)間15min、時(shí)間間隔6/9，破碎率達(dá)到65.23%。

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蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014-2-29) ；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)SRTP項(xiàng)目(20141030)