田海麗+全雪麗+秦嘉澤+吳松權(quán)

摘要：為了篩選適宜黃芩不定根生長的培養(yǎng)基和IBA濃度，研究了2種培養(yǎng)基B5、MS以及不同濃度IBA對不定根生長和總黃酮積累的影響。結(jié)果表明，B5+1.0 mg/L IBA為最適培養(yǎng)基，此時黃芩不定根生長狀態(tài)良好、健壯，生物量較多，并且總黃酮含量最高，達到2.49 mg/g，明顯高于其他處理。

關(guān)鍵詞：黃芩;不定根;IBA濃度;培養(yǎng)基;總黃酮

中圖分類號：S567.23+9.043 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2015）04-0065-02

收稿日期：2014-05-23

基金項目：吉林省科技項目（編號：201115228）。

作者簡介：田海麗（1990—），女，陜西寶雞人，碩士研究生，主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：tianhaili123@sina.com。

通信作者：吳松權(quán)，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物種質(zhì)研究。Tel：（0433）2435633;E-mail：arswsq@ybu.edu.cn。

黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）為唇形科黃芩屬多年生草本植物，別稱山茶根、黃金茶，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品[1]。黃芩以根入藥，其味苦性寒，有清熱除濕、瀉火解毒、止血安胎、鎮(zhèn)靜抗炎的功效[2-3]。黃酮類化合物是黃芩的有效成分，具有較強的抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗HIV、清除自由基等作用，并且其毒性小，不易產(chǎn)生耐藥性，生物安全性高[4-8]。這些特點使得黃芩的應(yīng)用和開發(fā)越來越受到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，需求量隨之急劇增加，致使野生黃芩被大量采挖，野生資源遭到了嚴(yán)重破壞，而黃芩在栽培過程中往往出現(xiàn)品質(zhì)下降、農(nóng)藥殘留等問題，市場供求矛盾日益尖銳。

不定根培養(yǎng)是一種植物器官培養(yǎng)方法，近年來正成為獲取特定次生代謝產(chǎn)物的有效手段之一，具有生長周期短、可人為控制生長條件、重復(fù)性強等優(yōu)點[9]。在目前的藥用植物不定根研究中，研究得較為透徹的是人參，如韓國在研究人參不定根培養(yǎng)方面取得了重大成就，已達到了工業(yè)化生產(chǎn)程度;我國科研人員也相繼對丹參、太子參、三七、紅豆杉、甘草、柴胡、蒼術(shù)、白術(shù)、東北刺人參、黃芪進行了研究[10]。但是目前還未發(fā)現(xiàn)利用黃芩不定根進行次生代謝的研究，因此本試驗以黃芩為材料誘導(dǎo)不定根，研究B5、MS培養(yǎng)基與不同IBA濃度的組合對不定根增殖的影響，以期通過測定生物量、總黃酮含量，優(yōu)化出最適宜的培養(yǎng)基與IBA激素濃度，為利用黃芩不定根規(guī)?；a(chǎn)黃酮類化合物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

黃芩種子采集于吉林省延邊朝鮮族自治州安圖縣。標(biāo)準(zhǔn)品蕓香苷購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;試驗中所用到的其他試劑均為分析純。

主要儀器為UV-3100紫外-可見分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃芩不定根誘導(dǎo) 選取籽粒飽滿的黃芩種子播種，待苗長至6 cm時，選取根部，先用自來水沖洗2 h，再分別用75%乙醇漂洗45 s、無菌水漂洗3次、0.1%氯化汞消毒 6 min、無菌水漂洗6次后切成1 cm×1 cm的外植體，接種于B5+2.0 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂、pH值為5.8的培養(yǎng)基上，于（25±1） ℃暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定根。

1.2.2 培養(yǎng)基及激素濃度組合的篩選 培養(yǎng)基為MS、B5，添加不同濃度的IBA（0、1、2、3、4、5 mg/L），培養(yǎng)基中其他成分同誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在（25±1） ℃條件下暗培養(yǎng)7周，60 ℃烘干后稱其干質(zhì)量，即為生物量。

1.2.3 總黃酮測定 （1）對照品溶液的制備：精確稱取1 mg蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL容量瓶中，先加30%乙醇溶解，再定容至10 mL，混勻后配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確量取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL對照品溶液，分別置于10 mL容量瓶中，加30%乙醇至5 mL，再分別加入 0.3 mL 5%亞硝酸鈉，混勻，靜置6 min;加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻，靜置6 min;加入2.0 mL 1 mol/L的氫氧化鈉溶液，再分別用30%乙醇定容至10 mL，靜置15 min，在 510 nm 波長處測定其吸光度D510 nm。以吸光度D510 nm為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=11.892 9x+0077 6，r2=0998 2。（3）樣品溶液制備：稱取100 mg烘干至恒質(zhì)量的黃芩不定根，在液氮中充分研磨，加入1 mL無水乙醇充分混勻，振蕩暗提取24 h，12 000 r/min離心10 min，收集上清液置于1 mL容量瓶備用。（4）樣品總黃酮的測定：精確量取 0.3 mL 樣品，以取樣0 mL為空白對照，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備步驟的“加入30%乙醇至5 mL”起，至“分別測其吸光度”，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品溶液中總黃酮的含量。

1.2.4 統(tǒng)計分析 使用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基與IBA濃度對不定根生長的影響

由表1可以看出，在B5、MS培養(yǎng)基中，不定根的生長能力不同，且2種培養(yǎng)基之間存在顯著性差異，B5培養(yǎng)基顯著優(yōu)于MS培養(yǎng)基，不定根在B5培養(yǎng)基中生長旺盛、分化多、白嫩、生長狀態(tài)良好、老化速度慢，而在MS培養(yǎng)基中不定根生長緩慢、分化少、易老化，且生物量少。從激素濃度看，IBA促進了黃芩不定根生長，B5培養(yǎng)基與IBA組合促進了黃芩不定根的生物量積累，顯著高于MS培養(yǎng)基與IBA組合;并且隨著IBA濃度的提高，不定根上的愈傷組織也隨之增多，當(dāng)IBA濃度為1.0 mg/L時，不定根生長旺盛、分化多、根長、基本無愈傷組織，生物量較大，達0.628 g;當(dāng)IBA濃度為4.0 mg/L時，生物量積累最大達0.641 g，但是此時不定根分化較少，且根長度較短，愈傷組織較多;當(dāng)IBA濃度為5.0 mg/L時，生物量有所減少，這可能與激素濃度過高有關(guān)。

表1 培養(yǎng)基與IBA濃度對黃芩不定根生物量的影響

培養(yǎng)基

類型

不同IBA濃度的不定根生物量（g）

0 mg/L 1.0 mg/L 2.0 mg/L 3.0 mg/L 4.0 mg/L 5.0 mg/L

B5 0.168j 0.628b 0.526d 0.612c 0.641a 0.436e

MS 0.128k 0.284g 0.242h 0.176i 0.304f 0.244h

注：表中數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母代表在0.05水平下差異顯著。表2同。

2.2 培養(yǎng)基與IBA濃度對黃芩培養(yǎng)基不定根總黃酮含量的影響

由表2可以看出，IBA對黃芩不定根總黃酮的累積有促進作用，添加IBA后不定根的總黃酮量明顯高于對照組，雖然MS培養(yǎng)基與IBA組合對總黃酮含量促進作用明顯高于B5培養(yǎng)基與IBA組合，但是B5培養(yǎng)基中不定根的生物量顯著高于MS培養(yǎng)基（表1），因此認為B5培養(yǎng)基更利于總黃酮的累積。IBA濃度為1.0 mg/L時，總黃酮含量最高，且與其他處理之間存在顯著性差異;當(dāng)IBA濃度為3.0 mg/L時，B5培養(yǎng)基總黃酮含量與對照無顯著性差異，而MS培養(yǎng)基與對照之間存在顯著性差異。因此可以認為，選擇適當(dāng)?shù)腎BA濃度才能增加黃芩不定根總黃酮的含量;萬貴香等研究也表明，適宜的外源激素才能促進黃芩愈傷組織中黃芩苷的積累[11]。

表2 培養(yǎng)基和IBA濃度對黃芩不定根總黃酮含量的影響

培養(yǎng)基

類型

不同IBA濃度的總黃酮含量（mg/g）

0 mg/L 1.0 mg/L 2.0 mg/L 3.0 mg/L 4.0 mg/L 5.0 mg/L

B5 1.54bcd 2.49a 1.54bcd 1.34cd 2.11ab 1.79abcd

MS 0.59e 2.03abc 1.57bcd 1.39bcd 1.06de 1.97abc

注同表1。

3 結(jié)論

由研究結(jié)果可以看出，無論是B5還是MS培養(yǎng)基，在供試IBA濃度范圍內(nèi)黃芩不定根生物量與總黃酮的累積都存在2個高峰。第1個高峰期為1.0 mg/L IBA，這可能是低濃度的IBA促進了不定根的生長與黃酮類物質(zhì)的積累;隨著IBA濃度增加，對其促進作用減小并逐漸形成激素脅迫使生物量與總黃酮減少;之后隨著IBA濃度進一步增加，不定根響應(yīng)激素脅迫而逐漸適應(yīng)了較高的IBA濃度，出現(xiàn)了第2個高峰期，在B5培養(yǎng)基生物量和總黃酮最高時期為4.0 mg/L處理，而MS培養(yǎng)基中生物量最高時期為4.0 mg/L處理，總黃酮最高時期為5.0 mg/L處理?？梢婞S芩不定根在不同培養(yǎng)基中應(yīng)對高濃度外源激素脅迫的能力是有不同的，總體可見，B5培養(yǎng)基中IBA濃度為1.0 mg/L時，總黃酮含量最高，達2.49 mg/g。

B5培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基主要區(qū)別在于培養(yǎng)基的銨態(tài)氮與硝態(tài)氮比值的差異，B5培養(yǎng)基銨態(tài)氮與硝態(tài)氮比值是MS培養(yǎng)基的1/6，銨態(tài)氮含量遠低于MS培養(yǎng)基，從而使硝態(tài)氮更利于不定根生長及總黃酮積累，這也可能是B5培養(yǎng)基優(yōu)于MS培養(yǎng)基的原因。Cui等研究發(fā)現(xiàn)，氮源類型影響不定根生長及次生代謝產(chǎn)物積累，硝態(tài)氮更利于不定根的生長[12]。本試驗表明，黃芩不定根在B5培養(yǎng)基中生長狀態(tài)良好，而且B5培養(yǎng)基生物量顯著高于MS培養(yǎng)基，使B5培養(yǎng)基總黃酮積累顯著高于MS培養(yǎng)基，推測是由于氮源類型的差異引起的，這還需要進一步的試驗鑒定。

參考文獻：

[1]周錫欽，張慶英，梁 鴻，等. 黃芩中主要黃酮類成分的含量分析[J]. 中國中藥雜志，2009，34（22）：2910-2915.

[2]張 瑜，武 斌. 黃芩藥理作用的研究進展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（6）：1091-1093.

[3]王 瑋，白 月，王俊平. 黃芩莖葉總黃酮對大鼠氣囊滑膜炎抗炎作用機制的研究[J]. 沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，10（1）：24-25.

[4]趙 梅，周淑琴. 黃芩中黃酮類化合物抗腫瘤作用的研究進展[J]. 中國藥房，2013，24（11）：1050-1052.

[5]Li-Weber M. New therapeutic aspects of flavones：the anticancer properties of Scutellaria and its main active constituents Wogonin，Baicalein and Baicalin[J]. Cancer Treatment Reviews，2009，35（1）：57-68.

[6]Zhang D Y，Wu J，Ye F，et al. Inhibition of cancer cell proliferation and prostaglandin E-2 synthesis by Scutellaria baicalensis[J]. Cancer Research，2003，63（14）：4037-4043.

[7]郭少英，程發(fā)峰，鐘相根，等. 黃芩苷的體外抗氧化研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2011，22（1）：9-11.

[8]李晨睿，牛銀波，潘亞磊，等. 黃芩藥動學(xué)研究進展[J]. 中國藥理學(xué)通報，2013，19（8）：1048-1053.

[9]Wu S Q，Lian M L，Gao R，et al. Bioreactor application on adventitious root culture of Astragalus membranaceus[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2011，47（6）：719-724.

[10]尹雙雙，高文遠，王 娟，等. 藥用植物不定根培養(yǎng)的影響因素[J]. 中國中藥雜志，2012，37（24）：3691-3694.

[11]萬貴香，馬 琳，張 堅. 不同濃度的外源激素對黃芩愈傷組織的生物量和黃芩苷含量的影響[J]. 中國中藥雜志，2012，37（24）：3799-3802.

[12]Cui X H，Murthy H N，Wu C H，et al. Adventitious root suspension cultures of Hypericum perforatum：effect of nitrogen source on production of biomass and secondary metabolites[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2010，46（5）：437-444.