劉欣偉，柳云恩，張玉彪，訾 英，安 舒，周大鵬，項(xiàng)良碧，侯明曉

1.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院骨科，遼寧沈陽(yáng) 110016;2.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng) 110016;3.解放軍第463醫(yī)院急診科，遼寧沈陽(yáng) 110042;4.沈陽(yáng)軍區(qū)興城療養(yǎng)院醫(yī)務(wù)部，遼寧興城 125100

脊髓損傷是指由于外界直接或間接因素導(dǎo)致脊髓的損傷。目前對(duì)脊髓損傷的治療都局限于創(chuàng)傷早期，以手術(shù)治療為主，恢復(fù)脊柱的穩(wěn)定性。但脊髓損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)多不佳，亦會(huì)發(fā)生一系列的原發(fā)性和繼發(fā)性病理生理改變［1-2］。褪黑素(melatonin，MT)對(duì)脊髓氧化性損害的保護(hù)作用逐漸被認(rèn)識(shí)，但對(duì)脊髓細(xì)胞凋亡及鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響報(bào)道較少。本研究通過觀察褪黑素對(duì)大鼠脊髓損傷后細(xì)胞凋亡及鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體1(Zn Transporter 1，ZnT1)表達(dá)情況的影響來探討其對(duì)脊髓損傷的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠54只，體重200～240 g，由沈陽(yáng)化工學(xué)院新藥安全評(píng)價(jià)中心動(dòng)物部提供，許可證號(hào):SYXK(遼)2006-0002。

1.1.2 試劑及儀器 褪黑素(北京索來寶公司)、TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(ROCHE公司)、免疫組化染色試劑盒及一抗ZnT1多克隆抗體(北京索來寶公司)。低溫冰箱(日本三洋公司)、電子天平及干燥箱(上海民橋科學(xué)精密儀器公司)、冰凍切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)、光學(xué)及倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、離心機(jī)(德國(guó)西格瑪公司)、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置(美國(guó)GE公司)、冷凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)GE公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分為3組，即假手術(shù)組、損傷組、褪黑素組，每組18只。

1.2.2 模型的建立及取材 將SD大鼠以水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后，備皮、常規(guī)消毒。取大鼠背部正中線作為脊柱體表投影，以T12椎體水平為中心點(diǎn)縱向切開皮膚、皮下組織，長(zhǎng)約2 cm。在手術(shù)顯微鏡下通過顯微外科手術(shù)器械，將大鼠棘突、椎板咬除，保留完整的硬脊膜(假手術(shù)組到此處結(jié)束手術(shù)、關(guān)閉切口)。應(yīng)用鉗夾法以血管夾鉗夾T12水平硬膜囊1 min，對(duì)顯露的脊髓組織造成損傷，損傷后觀察大鼠 BBB(Basso，Beattie and Bresnahan score)評(píng)分［3］，評(píng)分≤1即證實(shí)建模成功(損傷組到此處結(jié)束手術(shù))。生理鹽水沖洗傷口，對(duì)活動(dòng)性出血進(jìn)行止血，以0號(hào)絲線全層縫合、關(guān)閉切口。在實(shí)驗(yàn)組中，建模成功后即刻將褪黑素溶于無水乙醇溶劑中，然后用生理鹽水將溶液中乙醇濃度稀釋到5%以下，100 mg/kg對(duì)大鼠腹腔注射，1次/d。術(shù)后正常進(jìn)食進(jìn)水，人工輔助膀胱壓迫排尿3次/d。術(shù)后12、24、48 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取6只大鼠處死，取T11-L1節(jié)段長(zhǎng)約1 cm脊髓組織，以10%中性甲醛緩沖液固定，待固定完全后進(jìn)行脫水、包埋、切片。

1.2.3 檢測(cè)方法 (1)HE染色。(2)DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法(Tunel法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。(3)通過免疫組化(immunohistochemistry，IHC)及蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot，WB)檢測(cè)ZnT1表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下，可以觀察到假手術(shù)組組織結(jié)構(gòu)完好，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，神經(jīng)元較大，細(xì)胞核形態(tài)清晰，位置居中，胞質(zhì)富勻。損傷組可見部分神經(jīng)元受損，存在細(xì)胞胞體膨大、結(jié)構(gòu)不清晰，組織間隙充血，核縮且結(jié)構(gòu)不清，凋亡小體存在。褪黑素組中，病理組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)較損傷組得到一定程度的改善。見圖1。

圖1 3組大鼠術(shù)后48 h脊髓神經(jīng)元情況(HE×40)

2.2 Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 Tunel染色結(jié)果提示，凋亡的細(xì)胞鏡下表現(xiàn)為棕褐色或黃色，核縮、染色顆粒顏色較深，形態(tài)較不規(guī)則且散漫分布于損傷的范圍內(nèi)，其中假手術(shù)組凋亡較少，損傷組凋亡率最高;在12、24、48 h損傷組的凋亡率較假手術(shù)組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，褪黑素組的細(xì)胞凋亡率較損傷組則明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1，圖2。

表1 不同時(shí)間3組大鼠脊髓細(xì)胞凋亡率比較(±s)

表1 不同時(shí)間3組大鼠脊髓細(xì)胞凋亡率比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較，a P＜0.05;與損傷組比較，b P＜0.05。

48 h組別 n 凋亡率(%)術(shù)后12 h 術(shù)后24 h 術(shù)后假手術(shù)組6 16.18±1.51 18.14±2.16 17.33±1.76損傷組 6 68.31±5.12a 61.22±3.98a 53.38±4.25a褪黑素組 6 51.35±2.93ab 41.92±2.12ab 33.67±3.29ab

圖2 3組大鼠術(shù)后48 h脊髓細(xì)胞凋亡情況(TUNEL×100)

2.3 ZnT1的表達(dá)情況 免疫組化染色結(jié)果顯示，術(shù)后48 h各組中均可見ZnT1表達(dá)，其中在褪黑素組中表達(dá)最明顯，在損傷組中表達(dá)較假手術(shù)組增加不明顯。見圖3。

圖3 3組大鼠ZnT1術(shù)后48 h時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞情況(IHC×40)

2.4 WB檢測(cè)結(jié)果 WB檢測(cè)不同時(shí)間褪黑素組ZnT1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)褪黑素干預(yù)后，褪黑素組ZnT1表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖4。

圖4 褪黑素組中ZnT1隨時(shí)間變化的情況

3 討論

脊髓損傷是非常嚴(yán)重的疾病，多見于交通傷和戰(zhàn)傷等，在損害的相應(yīng)節(jié)段出現(xiàn)相應(yīng)的運(yùn)動(dòng)、感覺和括約肌功能障礙、肌張力異常及病理反射等改變［4-5］。目前，對(duì)脊髓損傷的治療都僅局限于創(chuàng)傷早期，以手術(shù)治療為主，盡早地解除對(duì)脊髓的壓迫，恢復(fù)脊柱的穩(wěn)定性。但脊髓損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)多不佳，預(yù)后也難以預(yù)料，因?yàn)榧顾钃p傷后的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜。脊髓損傷后會(huì)發(fā)生一系列的原發(fā)性和繼發(fā)性病理生理改變，包括脊髓水腫、氧自由基、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽以及多種酶活動(dòng)的改變等［6-7］。這些病理改變和相關(guān)酶類及生長(zhǎng)因子的變化會(huì)對(duì)脊髓損傷后的神經(jīng)功能產(chǎn)生重要的影響。近年來，隨著對(duì)脊髓損傷機(jī)制的研究不斷深入，脊髓組織水腫的作用逐漸引起重視。減少或阻斷脊髓水腫成為治療脊髓損傷的有效方法之一。目前，臨床一線治療藥物中的甲潑尼龍就有此類作用，但其不良反應(yīng)明顯。

褪黑素是松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有廣泛的生理功能，不僅參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律及生殖、甲狀腺、腎上腺等功能，還具有抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用，參與機(jī)體許多病理生理過程。目前褪黑素對(duì)脊髓氧化性損害的保護(hù)作用逐漸被認(rèn)知。既往研究中，褪黑素被證實(shí)可以保護(hù)氧自由基導(dǎo)致的核酸破壞［8］。褪黑素可以通過直接清除羥自由基、過氧化氫等組成的活性氧自由基，而達(dá)到強(qiáng)大的抗氧化作用，對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的作用也經(jīng)相關(guān)研究得到了驗(yàn)證［9］。但對(duì)褪黑素抑制急性脊髓損傷后脊髓組織水腫的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

鋅是機(jī)體必需的重要微量元素。研究表明，鋅是機(jī)體多種酶的必需組分或激活因子，與機(jī)體發(fā)育、骨骼生長(zhǎng)、免疫功能、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)和核酸代謝等一系列生理活動(dòng)密切相關(guān)，補(bǔ)充鋅能夠抑制或減輕一些神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［10-11］。相反，鋅缺乏能夠加重凋亡或加重脊髓損傷［12］。文獻(xiàn)證實(shí)，脊髓損傷后患者普遍存在不同程度的鋅缺乏以及血鋅丟失，而適當(dāng)增加鋅含量則對(duì)脊髓損傷具有保護(hù)作用［13-14］。本研究推測(cè)褪黑素能夠增加細(xì)胞內(nèi)鋅含量進(jìn)而增加神經(jīng)相關(guān)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，而這可能是褪黑素發(fā)揮對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。但鋅離子不能自由通過細(xì)胞膜，需要特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和膜通道參與轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體主要包括Slc39a/ZiP和Slc30a/ZnT兩大類，在鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用［15］。ZiP蛋白家族能夠促進(jìn)鋅離子從細(xì)胞外或細(xì)胞器的內(nèi)室涌入到細(xì)胞質(zhì)中［16］。相反，ZnT家族成員能夠從胞質(zhì)去除鋅離子，包括排入胞外或流入管腔小泡和細(xì)胞器內(nèi)［17］。本研究結(jié)果表明，褪黑素有利于損傷的脊髓組織修復(fù)，加之鋅對(duì)于脊髓的保護(hù)是有利因素，褪黑素提高ZnT的表達(dá)后，利于增加細(xì)胞內(nèi)鋅含量，進(jìn)一步起到脊髓保護(hù)的作用。

本研究表明，急性脊髓損傷后會(huì)出現(xiàn)明顯的脊髓組織病理改變，褪黑素干預(yù)可以減輕受損脊髓的損傷程度，使ZnT的表達(dá)上調(diào)。筆者推測(cè)，褪黑素影響ZnT表達(dá)是其發(fā)揮脊髓保護(hù)作用的機(jī)制之一，但其具體作用機(jī)制及信號(hào)通路尚有待進(jìn)一步研究。

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