王海光，寧宜寶?，賴月輝，吳文福，王芳，劉燦，張文利，黃秋雪，陳堅(jiān)，林旭埜，張毓金，范學(xué)政，徐璐，王琴，趙啟祖，丁家波

（1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣州511356）

豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)替代方法的研究

王海光1，寧宜寶1?，賴月輝2，吳文福2，王芳1，劉燦1，張文利1，黃秋雪2，陳堅(jiān)2，林旭埜2，張毓金2，范學(xué)政1，徐璐1，王琴1，趙啟祖1，丁家波1

（1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣州511356）

目前，我國(guó)豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)最常用的方法是測(cè)定豬瘟疫苗中病毒的兔體感染量（RID），但是用該方法易受到檢驗(yàn)兔品種、個(gè)體和飼養(yǎng)環(huán)境的影響。為了探索一種不依賴動(dòng)物的疫苗效力檢驗(yàn)新方法，本研究將待檢豬瘟活疫苗系列稀釋后分別接種易感細(xì)胞，使用抗原捕獲ELISA、RT-nestPCR和RT-PCR三種方法檢測(cè)不同稀釋度疫苗中活病毒在感染細(xì)胞后增殖的子代病毒，計(jì)算疫苗病毒的最高細(xì)胞感染劑量，建立了豬瘟疫苗病毒的細(xì)胞感染量（CID）的效力檢驗(yàn)方法。結(jié)果顯示：疫苗中活病毒粒子越多，CID就越高；對(duì)不同類型豬瘟疫苗的檢測(cè)結(jié)果表明，該方法適用于傳代細(xì)胞源和細(xì)胞源豬瘟活疫苗的效力效檢。使用CID和RID兩種檢測(cè)方法同時(shí)對(duì)12批豬睪丸傳代細(xì)胞源（傳代細(xì)胞源）和3批牛睪丸原代細(xì)胞源（細(xì)胞源）豬瘟活疫苗進(jìn)行了比對(duì)效檢，結(jié)果表明，用CID測(cè)定方法檢驗(yàn)，12批豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）每頭份均含105CID，3批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）每頭份含量均為104CID；用兔子感染體溫測(cè)定法，12批豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）每頭份含量在2.6×104～3.0×104RID之間，3批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）每頭份含7.0×103～8.0×103RID。試驗(yàn)證明：本實(shí)驗(yàn)室建立的CID檢測(cè)結(jié)果與現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)RID的結(jié)果存在良好的相關(guān)性，能夠較好反映疫苗中活病毒的含量，有望成為RID的替代方法。

豬瘟活疫苗；效力檢驗(yàn)；替代方法；兔體感染量；細(xì)胞感染量；抗原捕獲ELISA；RT-nestPCR；RT-PCR

豬瘟（classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的一種豬的烈性、急性傳染性疾病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物傳染病。我國(guó)培育的豬瘟兔化弱毒疫苗是國(guó)際上公認(rèn)最安全、有效的豬瘟疫苗之一，為我國(guó)乃至世界豬瘟的防控和消滅起到了重要的作用［1-2］。為了保證豬瘟活疫苗安全有效，疫苗的效力檢驗(yàn)方法顯得尤為重要。到目前為止，我國(guó)豬瘟兔化弱毒疫苗效力檢驗(yàn)方法一直是延用20世紀(jì)50年代建立的兔體感染量測(cè)定法［3］。由于不同品種、不同個(gè)體的試驗(yàn)兔對(duì)豬瘟兔化弱毒的敏感性存在差異［4］，同批豬瘟疫苗用不同品種的兔在不同地區(qū)進(jìn)行效力檢驗(yàn)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果，用兔子進(jìn)行豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，可重復(fù)性差等缺點(diǎn)，因此建立不依賴動(dòng)物的效力檢驗(yàn)替代方法是勢(shì)在必行。豬瘟活疫苗對(duì)宿主的免疫效力是通過病毒感染宿主細(xì)胞激活免疫系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)的，在一定范圍內(nèi)，宿主免疫疫苗的病毒量越大，對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的激活就越強(qiáng)，免疫效力就越好［5］。因此，豬瘟兔化弱毒疫苗的免疫效力可以通過測(cè)定疫苗中有細(xì)胞感染性活病毒的量（濃度）來(lái)評(píng)價(jià)。鐘明華等曾報(bào)道用新城疫病毒增強(qiáng)豬瘟病毒的致細(xì)胞病變來(lái)測(cè)定豬瘟疫苗的活病毒滴度替代動(dòng)物效力檢驗(yàn)的方法，但由于該方法致細(xì)胞病變不穩(wěn)定未能推廣使用。本試驗(yàn)旨在建立一種能夠客觀準(zhǔn)確檢測(cè)豬瘟疫苗中活病毒含量的效力檢驗(yàn)替代方法。

1 材料與方法

1.1 豬瘟疫苗凍干制品和豬瘟細(xì)胞毒濕毒

1.1.1 監(jiān)督抽檢豬瘟疫苗 14批豬瘟活疫苗，為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所從5個(gè)豬瘟疫苗生產(chǎn)企業(yè)監(jiān)督抽檢獲得。其中豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）4批，批號(hào)分別為201202、201209、201210和201211；豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）3批，批號(hào)為：201212、201213和201203批；豬瘟活疫苗（脾淋源）7批，批號(hào)為：201201、201204、201205、201206、201207、201208和201214批，所有疫苗均在有效期內(nèi)。

1.1.2 豬瘟兔化弱毒細(xì)胞液濕毒 不同代次收獲的豬瘟兔化弱毒細(xì)胞毒，由廣東永順生物制藥股份有限公司制備和提供。

1.1.3 RID與CID測(cè)定法比較檢測(cè)用豬瘟活疫苗12批豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源），批次分別為：ST2012036、ST2012037、ST2012038、ST2012041、ST2012042、ST2012043、ST2012044、ST2012046、ST2012047、ST2011054、ST2011055和ST2011056；3批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源），批次分別為：2012124、2012125和2012126。以上疫苗均由廣東永順生物制藥股份有限公司提供，所有疫苗均在有效期內(nèi)。

1.2 細(xì)胞及試驗(yàn)動(dòng)物

1.2.1 ST傳代細(xì)胞 由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和廣東永順生物制藥有限公司提供。

1.2.2 豬瘟抗原捕獲ELISA檢測(cè)試劑盒 購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司。

1.2.3 豬瘟RT-PCR檢測(cè)試劑盒 購(gòu)于北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司。

1.2.4 RT-nestPCR檢測(cè)方法 本實(shí)驗(yàn)室自建［2］。

1.2.5 兔 新西蘭大耳白兔，體重1.5～3.0 kg，由廣東永順生物制藥有限公司自繁自養(yǎng)。

1.2.6 RID測(cè)定 按2010版《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法測(cè)定［3］。

1.3 體外CID檢測(cè)方法的建立

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、病毒接種和樣品收獲

1.3.1.1 細(xì)胞準(zhǔn)備 細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液：取90 mL MEM（Invitrogen）培養(yǎng)液，加入10 mL新生牛血清（Invitrogen），4℃保存。細(xì)胞維持液：取97 mL MEM，加入3 mL新生牛血清，4℃保存。取生長(zhǎng)良好單層的ST細(xì)胞瓶，用胰酶消化后，再用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液配制成每毫升含1×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于25 cm2細(xì)胞瓶中，每瓶6 mL，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24～36 h，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成良好單層后備用。

1.3.1.2 病毒接種和樣品收獲 棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，將每頭份豬瘟兔化弱毒濕毒稀釋成10-1～10-6，每個(gè)稀釋度分別接種于4瓶長(zhǎng)成良好ST細(xì)胞單層的25 cm2細(xì)胞瓶，每瓶0.6 mL，留4瓶細(xì)胞不接種病毒作為空白對(duì)照，置于37℃、5% CO2溫箱中吸附4 h后，吸出毒液，每瓶加入6 mL維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。每4 d收一次毒，將上清液混合，另每次從每個(gè)稀釋度病毒液接種的4個(gè)細(xì)胞瓶中取出一瓶，吸出一半細(xì)胞上清，另一半留下連同細(xì)胞一起置于-20℃凍溶兩次以裂解細(xì)胞，以比較細(xì)胞上清液和細(xì)胞內(nèi)的豬瘟病毒含量。共收獲4次。1.3.2 抗原捕獲ELISA檢測(cè)法對(duì)待檢抗原最佳收獲代次、最高陽(yáng)性稀釋度和處理方式的比較 按豬瘟抗原捕獲ELISA檢測(cè)試劑盒說明書的操作程序?qū)ωi瘟疫苗進(jìn)行檢測(cè)。將檢測(cè)樣品分成兩組，一種按裂解液與樣品原液1∶1的比例混合裂解處理，一組不加裂解液處理，比較裂解液處理樣品對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；用ELISA分別測(cè)定各稀釋度毒液接種細(xì)胞后1～4收次樣品中的豬瘟病毒，按試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)判定檢測(cè)結(jié)果。以確定檢驗(yàn)的疫苗樣品最佳收獲時(shí)間和最高稀釋度。

1.3.3 不同類型豬瘟疫苗的比較檢測(cè) 采用抗原捕獲ELISA對(duì)14批3種不同類型的豬瘟疫苗成品進(jìn)行檢驗(yàn)，以確定該效檢方法適用檢測(cè)疫苗的類型。細(xì)胞培養(yǎng)、收毒和檢測(cè)操作流程同1.3.1和1.3.2。

1.3.4 幾種CID測(cè)毒方法的比較檢測(cè) 采用抗原捕獲ELISA、RT-PCR和RT-nestPCR方法對(duì)疫苗接種ST細(xì)胞后不同時(shí)間收集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

1.4 CID與RID檢測(cè)結(jié)果的比較 用細(xì)胞維持液將12批豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）和3批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）稀釋成10-1～10-6，取疫苗10-3～10-6每個(gè)稀釋度各0.6 mL接種1瓶細(xì)胞，吸附4 h后，吸出病毒液，按6 mL／瓶加入維持液，繼續(xù)在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每4 d收獲細(xì)胞上清液1次，連續(xù)收獲3次。采用豬瘟抗原捕獲ELISA試劑盒對(duì)所有樣品進(jìn)行檢測(cè)，并用豬瘟RT-nestPCR和RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行確認(rèn)。同時(shí)，對(duì)同一批次的疫苗按2010年版《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的兔體檢測(cè)方法測(cè)定每批疫苗每頭份中的RID含量，并與CID方法檢測(cè)得到的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 CID測(cè)定法對(duì)不同時(shí)間收獲豬瘟病毒濕毒樣品的檢測(cè)結(jié)果 豬瘟抗原捕獲ELISA對(duì)不同稀釋度豬瘟兔化弱毒接種ST細(xì)胞后不同時(shí)間細(xì)胞病毒感染的測(cè)定結(jié)果見表1。

表1結(jié)果表明：不同稀釋度豬瘟病毒接種細(xì)胞后第4天，僅在10-3和10-4稀釋度病毒液接種的細(xì)胞中檢測(cè)到豬瘟病毒，第8天時(shí)，可以在10-5和10-6稀釋度病毒液接種的細(xì)胞中檢測(cè)到豬瘟病毒，第12天可以在10-6稀釋度病毒液接種的所有細(xì)胞中檢測(cè)到豬瘟病毒，12 d與16 d收獲樣品的結(jié)果沒有差異；結(jié)果證明接種12 d，細(xì)胞中豬瘟病毒增殖已達(dá)高峰；細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞上清中豬瘟病毒含量沒有明顯差異，這與早期報(bào)道的結(jié)果基本相一致［6］；檢測(cè)樣品用裂解液處理在早期似乎能提高檢測(cè)陽(yáng)性水平，但對(duì)12 d收集的樣品，不影響抗原捕獲ELISA的檢測(cè)結(jié)果；用RT-nestPCR的檢測(cè)，在接毒后第4天就能在10-6稀釋度病毒液接種收獲的ST細(xì)胞上清中檢測(cè)到豬瘟病毒核酸，這一點(diǎn)與ELISA方法不一致；結(jié)果同時(shí)顯示，用豬瘟抗原捕獲ELISA檢測(cè)為“可疑”的12 d以上收獲的病毒樣品，用RT-nestPCR的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，證明這種可疑反應(yīng)為非特異性反應(yīng)。因此，在最終判定結(jié)果時(shí)，ELISA檢測(cè)結(jié)果“可疑”的樣品一律視為陰性。

2.2 CID測(cè)定方法對(duì)不同種類疫苗的檢測(cè)結(jié)果按所建立的抗原捕獲ELISA操作流程對(duì)14批不同廠家生產(chǎn)的豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）、豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）、豬瘟活疫苗（兔脾淋源）三種類型的豬瘟活疫苗進(jìn)行活病毒測(cè)定，結(jié)果見表2。

表1 不同稀釋度豬瘟兔化弱毒濕毒接種細(xì)胞后第4～16天收獲樣品的病毒檢測(cè)結(jié)果

表2 不同類型疫苗接種細(xì)胞后不同時(shí)間所收獲細(xì)胞上清樣品的豬瘟抗原捕獲ELISA檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表

表2結(jié)果表明：同表1顯示的結(jié)果一樣，稀釋病毒樣品接種后12天，病毒達(dá)到增殖高峰，以12天收獲細(xì)胞上清的檢測(cè)結(jié)果作為判定標(biāo)準(zhǔn)，將4批豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）每頭份稀釋到10-5接種的ST細(xì)胞，均可檢測(cè)到豬瘟病毒；3批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）只有稀釋10-4／頭份接種的細(xì)胞上清能檢測(cè)到豬瘟病毒，病毒含量比豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）的CID低10倍。而7批豬瘟活疫苗（兔源）所有稀釋度接種的細(xì)胞都沒有檢測(cè)到豬瘟病毒。由此可見，豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）和豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）適于使用CID替代方法進(jìn)行效檢，而在所有稀釋度豬瘟活疫苗（兔源）接種的細(xì)胞上清液中均沒有檢測(cè)到豬瘟病毒，是方法問題，還是疫苗質(zhì)量問題，還有待進(jìn)一步研究。

2.3 細(xì)胞感染量與兔體定型熱對(duì)豬瘟成品疫苗的比較檢測(cè)結(jié)果 將廣東永順生物制藥股份有限公司生產(chǎn)的12批豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）和3批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）用CID和RID測(cè)定法進(jìn)行比較檢測(cè)，結(jié)果見表3。

表3結(jié)果表明：抗原捕獲ELISA、RT-nestPCR和RT-PCR 3種方法對(duì)15批疫苗細(xì)胞感染毒量檢測(cè)結(jié)果完全一致；用3種方法檢測(cè)感染細(xì)胞上清液，所有12批豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）的病毒含量均為105CID／頭份，3批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）每頭份均為104CID；用兔檢測(cè)，12批豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）每頭份中的病毒含量均在2.6×104～3.0×104RID之間，3批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）每頭份含在7.0×103～8.0×103RID之間。

考慮到豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）的規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)為每頭份≥7500 RID，根據(jù)此次豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）體外活病毒含量測(cè)定其陽(yáng)性稀釋度均能夠達(dá)到105CID／頭份的檢測(cè)結(jié)果，初步可將體外動(dòng)物替代方法活病毒含量檢測(cè)的質(zhì)量合格標(biāo)準(zhǔn)定為疫苗稀釋度≥104.5CID／頭份檢測(cè)陽(yáng)性為合格。

表3 效檢替代方法與兔體定型熱法檢測(cè)結(jié)果

3 討論

豬瘟兔化弱毒可以在多種細(xì)胞上生長(zhǎng)，但均不產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE），因此無(wú)法通過直接觀察感染細(xì)胞的CPE來(lái)判定疫苗中豬瘟病毒的細(xì)胞感染量。本實(shí)驗(yàn)室建立的用稀釋后的豬瘟疫苗接種細(xì)胞，使用特異敏感的方法來(lái)測(cè)定細(xì)胞上清液中的病毒。多次試驗(yàn)證明：該方法客觀準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)，敏感性高，有效克服了兔子品種和飼養(yǎng)環(huán)境對(duì)豬瘟疫苗檢測(cè)結(jié)果的影響，這是本研究的一個(gè)重大突破。

在病毒接種細(xì)胞后的早期檢測(cè)中，雖然ELISA的檢測(cè)方法沒有檢測(cè)到病毒，而RT-nestPCR檢測(cè)到了，但試驗(yàn)同時(shí)證明，只有到病毒增殖到足夠量時(shí)，ELISA才能檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果，這證明ELISA方法檢測(cè)到的病毒是接種后的增殖到一定量的子代豬瘟病毒，因此在使用ELISA對(duì)豬瘟兔化弱毒疫苗進(jìn)行效檢時(shí)，應(yīng)采用接種病毒后10～12 d收獲的細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè)。RT-nestPCR檢出細(xì)胞中豬瘟病毒的時(shí)間比ELISA早得多，一方面是前者的敏感性比后者要高，另一方面是因?yàn)樵摲椒z測(cè)的病毒基因，不能區(qū)別死毒與活毒，4 d時(shí)在10-6疫苗接種的細(xì)胞上清中檢測(cè)的病毒核酸有可能是早期接種到細(xì)胞中尚未增殖的病毒，而疫苗效力檢驗(yàn)是要檢測(cè)活的有感染性的豬瘟病毒，所以RT-nestPCR早期的檢測(cè)病毒核酸結(jié)果只能作為參考［7-8］。

從細(xì)胞感染量與兔體定型熱對(duì)12批豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）比較檢測(cè)得到的結(jié)果來(lái)看，兩種方法存在良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，檢測(cè)陽(yáng)性滴度均為105，引起細(xì)胞感染與引起兔產(chǎn)生定型熱的豬瘟病毒含量基本是一致的。但是本試驗(yàn)中所測(cè)定的疫苗批次還比較少，應(yīng)增加不同企業(yè)利用同一種方法對(duì)多批疫苗的比較檢測(cè)，以得到一個(gè)更加準(zhǔn)確的疫苗質(zhì)量臨界判定值。

7批豬瘟活疫苗（兔脾淋源）的所有稀釋度毒液接種的ST細(xì)胞4～16 d收獲的細(xì)胞上清液中均沒有檢測(cè)到豬瘟病毒抗原，有可能是疫苗質(zhì)量問題，也有可能是用兔脾臟、淋巴結(jié)組織對(duì)ST細(xì)胞的病毒增殖能力有干擾抑制作用。因?yàn)楸?的結(jié)果顯示，有兩批豬瘟活疫苗（兔源）用10-1稀釋度接種細(xì)胞后4 d可見到ST細(xì)胞脫落死亡的現(xiàn)象。到底是方法問題，還是疫苗質(zhì)量問題，有待進(jìn)一步做深入研究。

［1］ 寧宜寶.獸用疫苗學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009.

［2］ Wang H，Ning Y，Ying C，et al.Development and application of a RT-nestPCR assay for differential detection of c-strain and wild-type viruses of classical swine fever virus［J］.Sustainable Agriculture Research，2013，2：27.

［3］ 中華人民共和國(guó)獸藥典［S］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010.

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（編輯：李文平）

WANG Hai-guang1，NING Yi-bao1?，LAI Yue-hui2，WU Wen-fu2，WANG Fang1，LIU Can1，ZHANG Wen-li1，HUANG Qiu-xue2，CHEN Jian2，LIN Xu-ye2，ZHANG Yu-jin2，F(xiàn)AN Xue-zheng1，XU Lu1，WANG Qin1，ZHAO Qi-zu1，DING Jia-bo1
（1.China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081，China；2.Guangdong Win-sun Bio-pharmaceutical Co.Ltd，Guangzhou 511356，China）

classical swine live vaccine；potency test；alternative strategy；CID；RID；ELISA；RT-nestPCR；RT-PCR

2015-02-01

A

1002-1280（2015）03-0001-06

S859.79

農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目（2011-G4）

王海光，碩士，從事動(dòng)物病毒研究。

寧宜寶。E-mail：ningyibao＠ivdc.org.cn

Development of an Alternative Potency Test Method for Classical Swine Fever Live Vaccine

Abstract：The potency detection method of C-strain vaccine based on classical swine fever virus rabbit infection dose（RID）is widely used in China，however，this method is greatly influenced by bread，individual difference and housing environment.In order to establish an alternative potency test strategy avoid using experimental animals，the permissive cell was inoculated with serial diluted vaccine，and then the antigen-capture ELISA，RT-nestPCR and traditional RT-PCR were utilized to detect the progeny virus.The highest positive dilution was termed as the indicator of the vaccine’s potency.The method of cell infection dose（CID）was established.The results showed that the higher live virus particles in vaccine，the higher dose of cell infection virus.Results from the potency tests of different types of C-strain vaccines indicated that the alternative strategy could be applied to potency test of ST cell-line produced C-strain vaccine and bovine testicular cell produced C-strain vaccine.Potency tests of 12 batches of ST cell-line produced C-strain vaccines and 3 batches of bovine testicular cell produced C-strain vaccines were conducted with both the alternative strategy CID and the RID test parallel.The results showed，the positive dilution of all 12 batches of ST cell-line produced C-strain vaccine were 105CID／dose，and 2.6×104～3.0×104RID／dose.And the positive dilution of 3 batches of bovine testicular cell produced C-strain vaccine were 104CID／dose and 7.0×103～8.0×103RID／dose.The potency test results of the alternative strategy CID were at certain extent corresponding to that of RID test，and it could reflect the concentration of infectious virus particles in vaccine.The alternative strategy CID is of potentiality to replace the RID test.