陳立英，王會軍，陶小雪，廖仁昊，張 穎，崔妍莉，劉芳芳

預先給予短暫的腦缺血預處理（BIP）可誘導缺血耐受（IT）［1］，激活內源性神經保護機制，減輕缺血再灌注所致的腦損傷，但人為地誘發(fā)IT是非常困難和難以想象的，在臨床上實施困難。近年來發(fā)現預先給予一些藥物也可誘導IT，此現象稱為藥物預處理［2］，研究表明阿司匹林（ASA）可誘導IT，具有直接神經保護作用，其機制可能為ASA的抗炎作用可減輕腦缺血再灌注后的炎癥級聯(lián)反應有關［3］。中藥大黃素甲醚（plyscion，Ply）屬蓼科植物大黃根莖所含的蒽醌衍生物之一，并具有很強的抗炎作用，已有前期研究證明Ply通過抗炎機制而起到腦保護作用［4］，但對IT的影響報道尚少見。本實驗利用大鼠缺血再灌注模型，觀察不同預處理方式對大鼠缺血再灌注損傷保護作用的影響，為缺血性腦血管的治療提供了一種有前途的新方法。

1 材料與方法

1.1 模型制造 將100只健康成年雄性SD大鼠（河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供）按隨機數值表法分為5組，每組20只。A組：假手術組，B組：腦缺血再灌注組，假手術3d后給予2h大腦中動脈閉塞（MCAO），再灌注22h后處死。C組：腦缺血預處理組，缺血預處理10min，3d后給予2hMCAO，再灌注22h后處死。D組：ASA預處理組，阿司匹林粉劑（河南華利藥業(yè)有限責任 公 司 提 供，批 號：0780633）以 60mg／kg 劑量溶于2mL生理鹽水中，灌胃3次，3d后給予2h MCAO，再灌注22h后處死。E組：Ply預處理組，大黃素甲醚（山東新華制藥股份有限公司提供，批號：0506338；以40mg／kg劑量溶于2mL生理鹽水中，灌胃3次，3d后給予2hMCAO，再灌注22h后處死。給予A、B、C組等量生理鹽水灌胃。

實驗動物用10%水合氯醛3ml／kg腹腔注射麻醉后，用Zea－longa等［5］的大腦中動脈線栓法制作大鼠左側大腦中動脈缺血灌注模型。采用頸部正中切口，結扎并切斷左側頸外動脈，在頸外動脈殘端剪一小口，并插入一根頂端粘有石蠟的尼龍絲線，向上深入至分叉以上（19～21）mm，結扎頸外動脈近心端，缺血（以插漁線成功開始計時）后2h實施再灌注，外拉漁線約20 mm恢復MCA供血，完成缺血預處理。假手術組除不插入漁線外，其余操作相同。造模成功標志：大鼠不能伸展右側前肢（即提尾時右前肢內收屈曲）、行走時向向右轉圈（追尾現象）或行走時向右側傾倒，出現上述三者之一即為造模成功。再灌注3d后用相同方法再次造成MCAO 2h，于處死前進行神經功能缺失評分，心臟取血，后斷頭處死。

1.2 神經功能缺失評分 按Zea Long5分制［5］標準評分，0分：無功能障礙；1分：不能完全伸展對側前爪；2分：向右側轉圈；3分：向右側傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.3 腦梗死體積測定 再灌注22h每組隨機選取10只動物斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，沿冠狀面用排刀切成5片，每片厚約2mm，置于2%TTC溶液中，避光染色30min，用10%甲醛緩沖液固定24h后用數碼相機照相，正常腦組織呈紅色，梗死組織呈白色，利用圖像分析法計算各個腦片梗死面積，并計算梗死體積。

1.4 腦組織白細胞介素1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）含量測定 再灌注22h后取每組另10只動物用10%的水合氯醛麻醉后處死，取出鼠腦剝離左側皮質，制成100g／L的腦組織勻漿，低溫離心1 5min（3 000r／min）。取上清液采用FFDFr－晶體閃爍計數儀，用放射免疫法測定各組動物腦組織IL－1β和TNF－α的含量。具體操作按大連生物工程公司生產的試劑盒進行。

1.5 統(tǒng)計學處理 計量資料以均數±標準差（x±s）表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，多組比較進行單因素方差分析及兩兩比較q檢驗，兩組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 神經功能缺失評分 假手術組無神經功能障礙表現。缺血預處理組、ASA預處理組及Ply預處理組神經功能缺失評分與缺血再灌注組比較明顯降低（P＜0.01）。Ply預處理組神經功能缺失評分明顯降低，與ASA預處理組比較明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 血清NSE含量 腦缺血再灌注組血清NSE含量與假手術組比較明顯升高 （P＜0.05）。缺血預處理組、ASA預處理組及Ply預處理組與腦缺血再灌注組比較血清NSE含量降低（P＜0.01）。Ply預處理組血清NSE含量與ASA預處理組比較明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.3 腦梗死體積 假手術組無肉眼可見的梗死灶形成。腦缺血再灌注組大鼠均表現不同程度的梗死灶形成。缺血預處理組、ASA預處理組及Ply預處理組與腦缺血再灌注組比較梗死體積縮?。≒＜0.01）。Ply預處理組梗死體積與ASA預處理組比較明顯縮?。≒＜0.05）。詳見表1。

表1 各組神經功能缺失、NSE、腦梗死體積比較（x±s）

2.4 腦組織IL－1β和TNF－α含量 腦缺血再灌注組腦組織IL－1β和TNF－α含量與假手術組比較明顯升高（P＜0.01）。缺血預處理組、ASA預處理組及Ply預處理組與腦缺血再灌注組比較病變側腦組織IL－1β和 TNF－α含量降低 （P＜0.05）。Ply預處理組腦組織IL－1β和TNF－α含量與ASA預處理組比較明顯降低 （P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組腦組織IL－1和TNF－α含量（x±s） ng／mL

3 討 論

BIP是指對腦組織采用機械刺激，如一次或多次短暫性腦缺血再灌注后，使其對以后較長時間的缺血性損傷產生IT［1］。其機制之一為抑制缺血后的炎癥反應，誘導腦組織產生內源性保護作用，減輕缺血再灌注所致的神經損傷。本實驗發(fā)現，提前給予BIP可以使再次缺血時神經功能缺失減輕，梗死體積縮小，血清NSE含量下降，均較缺血再灌注損傷組有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。近年來發(fā)現預先給予一些藥物也可誘導IT，此現象稱為藥物預處理［2］，研究表明ASA具有這種作用。提前給予ASA預處理可同樣使再次缺血時神經功能缺失減輕，梗死體積縮小，血清NSE含量下降，均較缺血再灌注損傷組有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

炎癥反應可能在缺血再灌注損傷及腦IT中具有重要意義，抗炎治療可減輕缺血再灌注所致的神經損傷［6］。Ply屬蓼科植物大黃的根及根莖所含的蒽醌衍生物之一，可通過血腦屏障，并具有很強的抗炎作用。已有前期研究證明Ply通過抗炎機制而起到腦保護作用［4］，但對IT的影響報道尚少見。本實驗發(fā)現，提前給予Ply預處理可以使再次缺血時神經功能缺失減輕，梗死體積縮小，血清NSE含量下降，均較ASA預處理組有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），中藥Ply亦可誘導IT產生腦保護作用，效果優(yōu)于ASA。

腦缺血后的再灌注損傷是一系列復雜的病理過程，主要與氧化應激反應、能量代謝障礙、炎性反應、興奮性氨基酸釋放、細胞凋亡及突觸傳遞受阻等有關［7］。其中炎性級聯(lián)反應是一個重要的損傷機制，各種炎癥因子的釋放在損傷機制中起著重要作用，一方面促進炎性細胞黏附于微血管內皮細胞，機械性堵塞微循環(huán)通道，影響組織的血流供應；另一方面促進相關炎性因子釋放，導致白細胞在缺血區(qū)浸潤和聚集，活化的白細胞在缺血區(qū)可釋放大量毒性氧自由基、蛋白水解酶等物質而進一步損傷局部組織血管，導致血管通透性增加而致組織水腫，加重組織損傷［8］。在炎性級聯(lián)反應中以炎性細胞因子（如IL－1β、TNF－α）表達上調為首發(fā)特征，IL－1β、TNF－α作為炎癥反應的起始因子，檢測其含量對衡量腦缺血再灌注損傷有重要意義［9］。本實驗采用放射免疫分析法動態(tài)觀察了不同預處理方式對大鼠腦缺血再灌注側腦組織IL－1β和TNF－α含量的變化。結果發(fā)現，缺血再灌注腦組織中IL－1β和TNF－α含量明顯升高，且均高于假手術組（P＜0.01）。缺血預處理組、ASA預處理組及Ply預處理組與腦缺血再灌注組比較病變側腦組織IL－1β和TNF－α含量降低 （P＜0.05）。該結果與相關報道一致［10］。表明IL－1β、TNF－α參與了腦缺血再灌注損傷的發(fā)生，在腦缺血性疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸中起一定的作用。而不同方式的預處理可能通過降低IL－1β和TNF－α在病灶側的過度表達，并對隨后發(fā)生的腦缺血再灌注損傷起保護性作用。

通過對不同方式預處理的比較，藥物預處理具有相對安全、方便、易于控制劑量的優(yōu)點，且中藥Ply具有更加廣闊的發(fā)展前景。本實驗有可能對臨床缺血性腦血管病的防治提供新的依據。

［1］ Kitagawa K，Matsumoto M，Tagaya M，etal.Ischemic tolerance phenomenon found in the brain［J］.Brain Res，1990，528（2）：21－24.

［2］ Zhao X，Strong R，Piriyawat P，etal.Caffeinol at the receptor level：Anti－ischemic effect of N－methy1－D－aspartate recepfor blockade is potentiated by caffeine［J］.Stroke，2010，41（2）：363－367.

［3］ 徐濤，曲方，周中和，等.阿司匹林對腦缺血－再灌注損傷大鼠神經保護作用的機制［J］.中國腦血管病雜志，2006，3：267－272.

［4］ 呂若華，蘇鉅年，周曉雯，等.大黃素甲醚對新生大鼠皮質神經元營養(yǎng)作用的靶點研究［J］.中國全科醫(yī)學雜志，2012，15：1730－1734.

［5］ Longa EZ，Weinstein PR，Carson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without crainietomy in rats［J］.Stroke，1989，20 （1）：84－91.

［6］ Huang J，Upadhyay UM，Tamargo RJ.Inflammation in strok and focal cerebral ischemia ［J］.Surg Neurol，2006，2006（3）：232－245.

［7］ Liao SL，Chen WY，Raung SL，etal.Association of immune reaponses and ischemic brain infarction in rat［J］.Neuroreport，2001，12（9）：1943－1947.

［8］ Gao XM，Liu Y，White D，etal.Deletion of macrophage migration inhibitory factor protects the heart from severe is chemiareperfusion injury：A predonminant role of anti－in flammation［J］.J Mol Cell Cardiol，2011，50（6）：991－999.

［9］ Folkersma H，Breve JJ，Tilders FJ，etal.Cerebral microdialysis of interleukin（IL）－1beta and IL－6：Extraction efficiency and production in the acute phase after severe traumatic brain injury in rats［J］.Acta Neurochir，2008，150（12）：1277－1279.

［10］ Oshima T，Lee S，Sato A，etal.TNF－alpha contributes to axonal sprouting and functional recovery following traumatic brain injury［J］.Brain Res，2009，1290（1）：102－104.