張寶榮，譚穎穎，張 琪

大量研究表明，婦女在絕經(jīng)后失去雌激素對(duì)心血管的保護(hù)作用，心腦血管疾病發(fā)病率顯著增加［1］。雌激素替代療法對(duì)改善絕經(jīng)后婦女的心血管疾病有效，但長(zhǎng)期應(yīng)用外源性激素，有增加子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等發(fā)病率的危險(xiǎn)［2］。藥理學(xué)研究表明葛根的主要有效成分異黃酮具有擴(kuò)張血管，抑制血小板聚集和抗氧化等作用，其中葛根素、大豆甙和金雀異黃素等具有明顯的雌激素樣作用［3，4］。雌激素可通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞功能而實(shí)現(xiàn)對(duì)心血管的保護(hù)作用［5］，但同樣具有雌激素活性的葛根異黃酮對(duì)絕經(jīng)后婦女或雌激素缺乏動(dòng)物內(nèi)皮功能的影響尚未見(jiàn)有報(bào)道。本研究主要觀察了葛根異黃酮對(duì)去卵巢大鼠血管內(nèi)皮功能的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 葛根異黃酮由陜西中醫(yī)學(xué)院新藥研究中心提供；去甲腎上腺素、乙酰膽堿和硝普鈉為Sigma公司產(chǎn)品；兔抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）一抗由Santa Cruz公司提供；Powerlab生物信號(hào)記錄系統(tǒng)為澳大利亞AD Instrument公司產(chǎn)品；雌二醇（E2）、內(nèi)皮素（ET）和 一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 實(shí)驗(yàn)選用雌性SD大鼠，體重250g～280g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成4組：假手術(shù)組（Sham）、卵巢切除組（OVX）、卵巢切除＋葛根異黃酮大劑量組（OVX＋TIPH）、卵巢切除＋葛根異黃酮小劑量組（OVX＋TIPL）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.3 去卵巢大鼠模型和給藥方法 大鼠2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，下腹部術(shù)區(qū)剪毛，仰臥位固定。嚴(yán)格消毒后，無(wú)菌條件下行下腹正中切口，逐層分離進(jìn)入腹腔，辨別出雙側(cè)卵巢后，完整切除，并逐層縫合切口。假手術(shù)組大鼠行相同手術(shù)過(guò)程，但不切除卵巢。術(shù)后第3天，將卵巢切除大鼠隨機(jī)分為3組，給予藥物灌胃。大劑量和小劑量治療組分別給予葛根異黃酮150 mg／kg和50mg／kg，給藥體積為1mL／100g體重，時(shí)間為12周。對(duì)照組大鼠給予等體積生理鹽水。大鼠在溫度22℃，濕度30%～40%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。

1.4 血清學(xué)檢測(cè) 各組大鼠經(jīng)以上藥物處理后，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，下腔靜脈取血，分離血清，使用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)血清雌二醇和內(nèi)皮素含量。硝酸還原酶法檢測(cè)一氧化氮（NO）水平。以上試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.5 主動(dòng)脈血管內(nèi)皮功能的檢測(cè) 分離各組大鼠的主動(dòng)脈，置于預(yù)冷的Kerb’s液中。將附著動(dòng)脈的結(jié)締組織剝離后，切制為寬約3mm的動(dòng)脈環(huán)形標(biāo)本。在含Kerb’s液的37℃浴槽中，將動(dòng)脈環(huán)懸掛，另一端連于張力換能器，并持續(xù)給予95%O2＋5%CO2的混合氣。張力換能器連接于Powerlab生物信號(hào)系統(tǒng)，記錄和分析動(dòng)脈環(huán)張力變化情況。當(dāng)動(dòng)脈環(huán)穩(wěn)定于基線后，浴槽中加入去甲腎上腺素（NE，106mol／L）收縮血管環(huán)，待動(dòng)脈環(huán)收縮達(dá)平衡狀態(tài)后，分別加入濃度為（10－9～10－5）mol／L的內(nèi)皮依賴性血管舒張劑乙酰膽堿（ACh），觀察血管的舒張反應(yīng)。然后，洗脫血管，重新平衡至基線，改用累加濃度為10－9～10－5mol／L的非內(nèi)皮依賴性血管舒張劑硝普鈉（SNP）重新舒張血管，測(cè)定各組非內(nèi)皮依賴性血管舒張功能。

1.6 Western blot提取蛋白后Bradford法測(cè)定蛋白含量。上樣后，SDS－AGE凝膠電泳分離蛋白。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白從聚丙酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。室溫下，脫脂奶粉（5%）封閉2h。兔抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶一抗（1∶500），4℃ 孵育過(guò)夜。TBS漂洗3次后，加入標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶的IgG二抗，室溫孵育30min。漂洗3次膜后，在暗室里加入ECL顯色2min，并曝光膠片（1～2）min，采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析蛋白印跡結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，使用sigmastat 3.0軟件處理。

2 結(jié) 果

2.1 血清E2、ET和NO水平變化 卵巢切除12周后，OVX組大鼠的E2和NO水平較Sham組大鼠顯著降低（P＜0.01），ET水平顯著增高（P＜0.01）。術(shù)后給予葛根異黃酮干預(yù)后，OVX＋TIPL和OVX＋TIPH組大鼠的E2、ET和NO水平與OVX組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 各組大鼠血清E2、ET和NO水平變化（x±s）

2.2 血管舒張反應(yīng)變化 在Sham組，加入濃度為（10－9～10－5）mol／L的內(nèi)皮依賴性血管舒張劑乙酰膽堿后，動(dòng)脈環(huán)呈現(xiàn)濃度依賴性舒張；而在OVX組，動(dòng)脈環(huán)對(duì)乙酰膽堿的舒張反應(yīng)出現(xiàn)顯著性障礙（P＜0.01）。給予葛根異黃酮干預(yù)后，與OVX組相比，OVX＋TIPL和OVX＋TIPH組的動(dòng)脈環(huán)對(duì)乙酰膽堿的舒張反應(yīng)顯著性增高（P＜0.05，見(jiàn)圖1A）。使用濃度為10－9～10－5mol／L的非內(nèi)皮依賴性血管舒張劑硝普鈉舒張血管，各組血管環(huán)對(duì)硝普鈉的舒張效應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖1B）。

圖1 各組大鼠內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)變化

2.3 內(nèi)皮組織eNOS蛋白的表達(dá)變化 OVX組較Sham組大鼠eNOS表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而OVX＋TIPL和OVX＋TIPH組與OVX組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠內(nèi)皮組織eNOS蛋白的表達(dá)變化

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管腔表面的單層上皮，形成血管的內(nèi)壁。其不僅是循環(huán)血液與血管平滑肌間的屏障，也是人體重要的內(nèi)分泌器官。血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是心血管疾病早期事件之一，也是多種心血管疾病形成的關(guān)鍵病理特征。在正常和受損狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞可分泌多種血管活性物質(zhì)，如內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ、血栓素 A2、一氧化氮、前列環(huán)素、緩激肽等［5，6］。其中，一氧化氮和內(nèi)皮素是關(guān)鍵的活性分子。動(dòng)脈內(nèi)皮功能受損時(shí)，一氧化氮的合成和釋放減少，內(nèi)皮依賴性的舒張功能出現(xiàn)下降。用乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮舒張反應(yīng)是評(píng)估血管內(nèi)皮舒張功能的經(jīng)典方法［7］。乙酰膽堿對(duì)正常的動(dòng)脈表現(xiàn)為舒張反應(yīng)，而在內(nèi)皮功能受損時(shí)則出現(xiàn)舒張反應(yīng)降低或出現(xiàn)收縮反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，去卵巢大鼠的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)顯著下降，而不同劑量的葛根異黃酮可以不同程度的改善受損的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，其中150mg／kg葛根異黃酮作用較強(qiáng)。另外，L－NAME預(yù)處理可明顯阻斷葛根異黃酮對(duì)去卵巢大鼠血管的舒張反應(yīng)，提示葛根異黃酮增加去卵巢大鼠主動(dòng)脈血管的舒張反應(yīng)依賴于一氧化氮。而血清檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，葛根異黃酮可以顯著增加去卵巢大鼠的一氧化氮水平，并降低內(nèi)皮素的含量。這說(shuō)明葛根異黃酮可以顯著改善去卵巢大鼠受損的內(nèi)皮功能，具有保護(hù)血管內(nèi)皮的作用。

雌激素受體可表達(dá)分布于動(dòng)物和人的血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞［8］。雌激素替代治療可改善絕經(jīng)期婦女血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)分泌功能，調(diào)節(jié)血管的舒張功能，并可增加一氧化氮合酶的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)一氧化氮的合成和分泌，提高一氧化氮的活性。表明雌激素可以通過(guò)一氧化氮途徑改善受損血管內(nèi)皮介導(dǎo)的舒張反應(yīng)。已有研究發(fā)現(xiàn)異黃酮genistein和大豆黃酮等對(duì)雌激素受體的選擇作用比雌二醇高（2～10）倍左右，大豆黃酮是葛根異黃酮的成分之一［9］。因此葛根異黃酮可能通過(guò)雌激素受體直接影響動(dòng)脈內(nèi)皮功能。葛根異黃酮可以顯著增加去卵巢大鼠的雌激素水平。這說(shuō)明葛根異黃酮改善內(nèi)皮功能與其類雌激素樣作用有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠的內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)降低，而葛根異黃酮可以上調(diào)異常的eNOS表達(dá)。eNOS表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可以在L－Arg和分子氧為底物下合成一氧化氮，調(diào)控內(nèi)皮功能。該結(jié)果提示葛根異黃酮也可以通過(guò)直接或間接影響eNOS表達(dá)，發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)效應(yīng)。葛根異黃酮具有保護(hù)去卵巢大鼠血管內(nèi)皮的功能，其機(jī)制與類雌激素樣作用、上調(diào)eNOS表達(dá)和降低內(nèi)皮素水平等因素有關(guān)。

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