何松堅(jiān)，吳 鏗，游 瓊，李尚海

硫化氫（H2S）被證實(shí)具有舒張血管、減輕炎癥反應(yīng)、減少心肌梗死的范圍和死亡率，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于氧化應(yīng)激的作用。H2S主要是通過L－半胱氨酸或同型半胱氨酸為底物，通過胱硫醚－γ－裂解酶（CSE）或胱硫醚－β－裂解酶，以吡多醛5’－磷酸鹽和3－硫基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3－MST）為協(xié)同因子參與反應(yīng)合成。在H2S的產(chǎn)生中涉及CBS、CSE及3－MST，這些酶具有組織的特異性。在硫化氫的代謝通路中，起關(guān)鍵作用的限速酶是胱硫醚β合成酶（CBS）。本研究測(cè)定經(jīng)冠脈造影證實(shí)正常對(duì)照組和冠心病組空腹血漿中硫化氫的含量，評(píng)估患者血漿中硫化氫濃度與冠心病的相關(guān)性；評(píng)估硫化氫與血小板聚集功能的相關(guān)性；探究硫化氫氣體濃度的改變是否與代謝通路中代謝酶活性的改變有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 分組 入選2012年1月—2014年6月在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科住院的200例患者，分為兩組：冠脈正常組（a組，n＝99）、冠脈造影提示冠狀動(dòng)脈血管光滑，無明顯管腔狹窄（正常）或冠狀動(dòng)脈無明顯影響血流動(dòng)力學(xué)的粥樣硬化病變（小于50%狹窄）；冠心病組（b組，n＝101）、冠脈造影證實(shí)的管腔直徑狹窄＞50%狹窄，b組分為穩(wěn)定型心絞痛組（b1組，n＝34）、不穩(wěn)定型心絞痛組（b2組，n＝35）及心肌梗死組（b3組，n＝32）。

1.2 入選排除標(biāo)準(zhǔn) 入選標(biāo)準(zhǔn)：擬行冠脈造影；年齡＞18歲；簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定；妊娠；伴有嚴(yán)重感染；肝功能實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)超過正常范圍上限2倍者；血清肌酐大于4.0mg／dL；嚴(yán)重精神疾患者；出血病史或凝血功能障礙；血小板數(shù)小于正常值下限；預(yù)期壽命小于1年者。

1.3 研究方法

1.3.1 血標(biāo)本留取和保存 a組和b組常規(guī)抽取臨床指標(biāo)：血小板計(jì)數(shù)、血小板聚集率檢測(cè)、三酰甘油、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白。另空腹抽取4 mL全血，放置于EDTA 抗凝管中，于3 000轉(zhuǎn)，10 min分離為血漿和血細(xì)胞，放置于－80℃低溫冰箱保存。

1.3.2 胱硫醚－γ－裂解酶活性檢測(cè) 用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗CTH抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗CTH抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣本中的CTH呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣本濃度。

1.3.3 胱硫醚－β－合成酶活性檢測(cè) 用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗CBS抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗CBS抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣本中的CBS呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣本濃度。

1.3.4 血漿中H2S含量的測(cè)定 采用敏感硫電極法測(cè)定。儀器：離子計(jì)（PXS－270上海雷磁）、敏感硫電極（Pag／S1上海雷磁）。抗氧化液配制：NaOH 8g，EDTA 7g加去離子水85mL，配制成存儲(chǔ)液，臨使用前加入抗壞血酸10g，即抗氧化液。測(cè)定a組和b組血漿中H2S的濃度：取人空腹血漿加入等體積抗氧化液，其總量應(yīng)以加入測(cè)定容器后能淹沒過電極為準(zhǔn)（通常需＞0.8mL），測(cè)定后據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出H2S濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS軟件，使用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，使用回歸分析評(píng)估患者血漿中硫化氫的濃度與冠心病的相關(guān)性及與血小板聚集功能的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 基線資料 200例患者中，男性109例；年齡（62±12）歲。詳見表1。

表1 各組間基線資料比較

2.2 血漿CSE活性測(cè)定 冠心病患者組血漿CSE活性明顯低于冠脈正常組（P＜0.01），且穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組及心肌梗死組血漿CSE活性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表2。

表2 冠心病組血漿CSE活性（x±s）

2.3 胱硫醚－β－合成酶活性檢測(cè) 冠心病組血漿CBS活性明顯低于冠脈正常組（P＜0.01），且穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組及心肌梗死組血漿CBS活性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表3。

表3 冠心病組與血漿CBS活性（x±s）

2.4 血漿中H2S含量及血小板聚集率PAR的測(cè)定冠心病組血漿H2S含量明顯低于冠脈正常組（P＜0.01），且穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組及心肌梗死組血漿H2S含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），血漿H2S濃度與血小板聚集功能的相關(guān)性分析：血漿H2S濃度與PAR呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.85，P＜0.01）。詳見表4。

表4 冠心病組血漿H2S含量及血小板聚集率PAR（x±s）

3 討 論

早期H2S曾被認(rèn)為是一種無色具有臭雞蛋氣味的毒性氣體，然而在20世紀(jì)九十年代，H2S被認(rèn)為是繼NO和CO后具有保護(hù)心血管系統(tǒng)作用的第三種氣體信號(hào)分子。在20世紀(jì)九十年代中期，H2S被證實(shí)具有舒張血管［1，2］、減輕炎癥反應(yīng)［3，4］、減少心肌梗死的范圍和死亡率［5，6］，具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于氧化應(yīng)激的作用［4，7］。近年的研究也表明，H2S在人體內(nèi)起著重要的生物學(xué)作用，它在血管和神經(jīng)體液平衡上的重要作用主要表現(xiàn)在：代謝調(diào)節(jié)、心臟保護(hù)、血管舒張、抗血小板聚集、血管氧敏感、內(nèi)皮保護(hù)、血管炎癥、通氣控制和神經(jīng)調(diào)節(jié)等方面［4，8］。在人體中，它主要是通過 L－半胱氨酸或同型半胱氨酸為底物，通過胱硫醚－γ－裂解酶或胱硫醚－β－裂解酶，以吡多醛5’－磷酸鹽和3－硫基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3－MST）為協(xié)同因子參與反應(yīng)合成。其代謝過程分為酶催化過程和非酶催化過程［9，10］。非酶催化過程盡管不重要，但是卻可以通過非酶催化的方式使人體內(nèi)主要的含硫化合物或多聚硫化物轉(zhuǎn)化為H2S，該反應(yīng)是通過葡萄糖支持及硫醇依賴的細(xì)胞反應(yīng)及谷胱甘肽依賴的非細(xì)胞反應(yīng)。酶催化過程是指在H2S的產(chǎn)生中涉及胱硫醚β合成酶、胱硫醚－γ合成酶及3－巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶，這些酶具有組織的特異性，不同的組織富含酶的含量有所不同。CBS主要存在于大腦的中樞神經(jīng)系統(tǒng)及部分血管內(nèi)皮細(xì)胞中［11］；CSE主要在心臟、肝臟、腎臟及血管平滑肌細(xì)胞中含量豐富，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中也存在少量的CSE［12］，3－MST 主要存在于大腦中［13，14］。H2S同 NO 和 CO作為人體內(nèi)重要的生物調(diào)節(jié)介質(zhì)，具有快速滲透細(xì)胞膜內(nèi)而不需要依附載體。H2S已經(jīng)被指出在調(diào)節(jié)血管張力、心肌收縮力、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和胰島素的釋放方面發(fā)揮了重要的作用［15－17］。H2S的缺乏會(huì)導(dǎo)致各種各樣的病理生理改變?nèi)绺哐獕?、心肌缺血，阿爾茨海默病、胃潰瘍、肝硬化，在心血管系統(tǒng)方面，研究最多的是H2S與心肌缺血－再灌注損傷的關(guān)系［18，19］。綜合多方面的研究，可以看出H2S具有舒張血管、抗炎、抗細(xì)胞增殖的作用。

在硫化氫的代謝通路中，起關(guān)鍵作用的限速酶是胱硫醚－β－合成酶，它可以使同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成 H2S和胱氨酸的前體胱硫醚。CBS是體內(nèi)唯一使 Hcy轉(zhuǎn)為最終代謝產(chǎn)物H2S的酶，代謝途徑是不可逆的。由于CBS的基因突變導(dǎo)致CBS的活性缺乏是引起代謝通路中硫化氫含量降低的主要原因［20］。

本研究通過檢測(cè)各組血漿CBS活性發(fā)現(xiàn)，冠心病組血漿CBS活性明顯低于冠脈正常組，且穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組及心肌梗死組血漿CBS活性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即隨著冠脈病變的加重及病情惡化，血漿CBS活性逐漸下降，即血漿CBS活性與冠脈病變的加重呈負(fù)相關(guān)。

關(guān)于H2S的國內(nèi)研究包括，在2007年，Zhu的團(tuán)隊(duì)報(bào)道急性心肌缺血的小鼠模型通過H2S介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮心血管保護(hù)作用［21］；2008年 Wang的團(tuán)隊(duì)有直接的證據(jù)表明H2S是生理的血管舒張劑和血管壓力的調(diào)節(jié)者［22］；2010年，Wang的團(tuán)隊(duì)還提供證據(jù)表明，胱硫醚－γ－裂解酶的缺乏與血管平滑肌的異常增殖有關(guān)［23］。本研究通過檢測(cè)各組血漿CSE活性發(fā)現(xiàn)，冠心病組血漿CSE活性明顯低于冠脈正常組，且穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組及心肌梗死組血漿CSE活性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即隨著冠脈病變的加重及病情惡化，血漿CSE活性逐漸下降，即血漿CSE活性與冠脈病變的加重呈負(fù)相關(guān)。

在本研究中，冠心病組H2S濃度明顯低于對(duì)照組。并且隨病變程度的加重逐漸降低，提示血漿H2S水平在冠心病的發(fā)病過程中可能起著保護(hù)作用，其在血漿濃度高低與冠脈病變程度相關(guān)。冠心病患者中的血漿含量在吸煙者較不吸煙者、具高血壓者較無高血壓者皆顯著下降，與血糖呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)性，表明血漿H2S含量的減少可能不僅與冠心病的病情嚴(yán)重程度、冠脈血管病變情況相關(guān)，而且與冠心病危險(xiǎn)因素吸煙、高血壓、高血糖密切相關(guān)。H2S作為一種新型的氣體信號(hào)分子具有心臟保護(hù)的作用，在心肌缺血的患者血漿中測(cè)定硫化氫的含量，可以評(píng)估患者心肌缺血的程度以及對(duì)患者預(yù)后的指導(dǎo)。

本研究通過血漿H2S濃度與血小板聚集功能的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血漿H2S濃度與PAR呈負(fù)相關(guān)，證明了H2S可降低冠心病患者的血小板聚集率，為臨床上外源性吸入H2S可降低冠心病患者的血液黏度提供了一定的依據(jù)。

本研究檢測(cè)血漿H2S濃度與胱硫醚－γ－裂解酶及胱硫醚－β－裂解酶的血漿活性，初步推測(cè)H2S氣體濃度的改變與代謝通路中CSE及CBS活性的改變有關(guān)。

本研究的缺點(diǎn)在于為單中心研究，樣本量不足，確切的結(jié)論需要大樣本資料進(jìn)一步觀察研究。

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