唐 英，吳曉牧，胡 凡，柴 文，胡國(guó)柱，吳梨華，張昆南

糖尿?。―M）患者大血管病變是其死亡的主要原因，其心、腦血管疾病的發(fā)病率均顯著高于非糖尿病人群［1，2］。但單純高血糖與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系及其可能機(jī)制仍不十分清楚。本研究以單純高血糖為特征的2型糖尿病模型大鼠為研究對(duì)象，觀察高血糖是否能引起頸動(dòng)脈脂紋、脂質(zhì)斑塊形成，以及其與血糖、血脂、同型半胱氨酸及果糖胺之關(guān)系，探討糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 12周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠（260g～280g）50只（購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），40%脂肪的胰島素抵抗誘導(dǎo)模型食料（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司），大鼠胰島素（INS）酶聯(lián)免疫試劑盒（美國(guó) Millipore公司），全自動(dòng)生化儀（日本HITACHI 7600－120）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及分組 SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組（對(duì)照組12只）和糖尿病模型組（38只），均高脂飼料喂養(yǎng)，每只大鼠每天定量25g，自由飲水，自然晝夜照明，相對(duì)濕度為50% ～70%，室溫（22～24）℃。4周后，隔夜空腹12 h，造模組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）溶液35mg／kg；對(duì)照組腹腔注射0.1mol／L檸檬酸鈉緩沖液。72h后禁食8h～12h大鼠尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖（FBG），以血糖濃度＞16.7mmol／L以上為2型糖尿病大鼠模型造模成功，達(dá)到模型標(biāo)準(zhǔn)且未死亡的共30只。30只糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為糖尿病1月組（DM1組），3月組（DM3組）和5月組（DM5組），每組10只大鼠。但實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)由于糖尿病模型大鼠出現(xiàn)死亡，因此DM1組最后為9只，DM3組為10只，DM5組為8只。

1.2.2 大鼠體重 采用電子盤(pán)稱每1周稱體重1次。

1.2.3 大鼠血液樣本采集 0月，1月，3月，5月空腹大鼠乙醚麻醉后內(nèi)眥靜脈取血，室溫放置30min后3 000r／min離心15min分離血清，－80℃保存。

1.2.4 空腹血糖測(cè)定 采用已糖激酶法通過(guò)全自動(dòng)生化儀測(cè)定外周血空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）。

1.2.5 胰島素測(cè)定 采用ELISA方法測(cè)定大鼠空腹血清胰島素，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行，胰島素含量根據(jù)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得。

1.2.6 血清生化指標(biāo)測(cè)定 三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）、同型半胱氨酸 （HCY）和果糖胺（FMN）含量采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定。

1.2.7 形態(tài)學(xué)觀察 分別于采血后經(jīng)水合氯醛腹腔麻醉大鼠，開(kāi)胸、開(kāi)腹，夾閉腹主動(dòng)脈，將連有輸液器的針頭插入左心室并剪開(kāi)右心耳，先灌注150mL生理鹽水，隨后用4.0%多聚甲醛進(jìn)行灌注。待灌注完成后取出左側(cè)頸總動(dòng)脈，將所得血管放入裝有4.0%多聚甲醛的容器中固定4h～6h，包埋，石蠟切片厚4 μm，切片脫蠟水化，常規(guī)HE染色，光鏡觀察動(dòng)脈粥樣硬化病變。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD比較，方差不齊時(shí)用秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)采用Person法。

2 結(jié) 果

2.1 各組動(dòng)脈壁的病理改變 糖尿病組動(dòng)脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞層下基質(zhì)層變厚，有核細(xì)胞增多，核變大，3月時(shí)可見(jiàn)血管壁局限增厚，可觀察到少許泡沫細(xì)胞，5月時(shí)泡沫細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)明顯增多，但較3月時(shí)多，尚未形成典型粥樣斑塊，符合動(dòng)脈粥樣硬化的早期病理改變。糖尿病組中膜層結(jié)構(gòu)變疏松，彈性纖維減少，間距變大，許多平滑肌細(xì)胞核變大，變圓，細(xì)胞變短，由收縮型變?yōu)楹铣尚?，并出現(xiàn)了平滑肌細(xì)胞的遷移。而對(duì)照組動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)平整，內(nèi)皮細(xì)胞光整，排列規(guī)則，動(dòng)脈中膜平滑肌仍為收縮型，為正常大鼠血管。

2.2 各組血糖、血脂、同型半胱氨酸和果糖胺水平比較 糖尿病各組與對(duì)照組比較，F(xiàn)BG，TC，TG，LDLC，HCY，F(xiàn)MN等差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；DM1組 HDL－C 高于對(duì)照組（P＜0.01）；各模型組之間FBG，TC，HCY，F(xiàn)MN差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組血糖、血脂、同型半胱氨酸和果糖胺水平比較（x±s）

3 討 論

根據(jù)2型糖尿病發(fā)病機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選用SD大鼠先喂以高脂飼料1月誘導(dǎo)胰島素抵抗，然后一次性腹腔注射低劑量STZ 35mg／kg誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠產(chǎn)生高血糖。STZ注射后72h時(shí)，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠FBG急劇增加至16.7mmol／L以上，同時(shí)出現(xiàn)多飲、多食、多尿等癥狀，雖然隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，模型組血糖水平有逐漸下降的趨勢(shì)，但是至成模5月后仍高于正常水平，糖尿病模型建立成功且穩(wěn)定。糖尿病動(dòng)物模型造模前后均給高脂飼料喂養(yǎng)。

本研究中，用HE染色觀察糖尿病大鼠動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該糖尿病動(dòng)物模型動(dòng)脈壁特點(diǎn)為：內(nèi)皮細(xì)胞層下基質(zhì)層變厚，有核細(xì)胞增多，核變大，變圓，細(xì)胞變短，向內(nèi)皮遷移，內(nèi)皮細(xì)胞聚集變形，形成纖維帽；血管壁局限增厚，可觀察到泡沫細(xì)胞，至5月時(shí)已形成脂紋，此變化符合動(dòng)脈粥樣硬化病理變化的早期改變［3］，中膜層結(jié)構(gòu)變疏松，彈性纖維增生，呈玻璃樣變，許多平滑肌細(xì)胞由收縮型變?yōu)楹铣尚停⒊霈F(xiàn)了平滑肌細(xì)胞的遷移。而對(duì)照組大鼠動(dòng)脈內(nèi)膜層光滑，無(wú)脂質(zhì)沉積，無(wú)泡沫細(xì)胞，中膜層平滑肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核清晰。上述病理結(jié)果提示，糖尿病大鼠已發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，其顯著特點(diǎn)是泡沫細(xì)胞和脂紋的形成，以及早期出現(xiàn)的平滑肌細(xì)胞的變形、遷移和增殖。

動(dòng)脈粥樣硬化是一種脂質(zhì)相關(guān)的慢性炎癥免疫疾病，動(dòng)脈粥樣硬化的形成是一個(gè)緩慢而復(fù)雜的過(guò)程，血脂沉積于損傷的動(dòng)脈內(nèi)膜，脂肪沉積刺激動(dòng)脈內(nèi)壁平滑肌細(xì)胞和纖維細(xì)胞增生，增生不斷發(fā)展連成纖維斑塊，大量炎癥免疫細(xì)胞聚集在動(dòng)脈粥樣斑塊中［4］，從而造成血管病變、微循環(huán)障礙及血液流變學(xué)改變，最終導(dǎo)致心腦血管病變發(fā)生，嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量。LDL－C、高濃度的TG和TC已被證實(shí)是動(dòng)脈粥樣硬化疾病的主要危險(xiǎn)因素［5］。在本研究中，模型組各組的TC、TG、LDL－C與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；說(shuō)明模型組在血糖升高的同時(shí)也伴隨著血脂濃度的升高，它們共同促進(jìn)血管的動(dòng)脈粥樣硬化。

高同型半胱氨酸可能通過(guò)以下機(jī)制導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成及腦梗死的發(fā)生：①通過(guò)氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞；②LDL形成復(fù)合物后被巨噬細(xì)胞吞噬，形成泡沫細(xì)胞；③刺激血管平滑肌細(xì)胞的增殖；④增加血小板凝血烷的合成，破壞機(jī)體凝血與纖溶系統(tǒng)之間的平衡；⑤促進(jìn)細(xì)胞凋亡；⑥其他如炎癥反應(yīng)等。通過(guò)上述機(jī)制過(guò)多、過(guò)高的同型半胱氨酸可以腐蝕損害血管造成血栓的形成。在本研究中，模型組各組的HCY與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；說(shuō)明模型組在血糖升高的同時(shí)也伴隨著HCY濃度的升高，它們共同促進(jìn)血管的動(dòng)脈粥樣硬化。輕度升高的同型半胱氨酸血癥與心腦血管疾病之間無(wú)內(nèi)在的必然聯(lián)系或聯(lián)系很?。?］。同型半胱氨酸的致動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究和探討。

高血糖動(dòng)物模型出現(xiàn)了明確的動(dòng)脈粥樣硬化的部分特征性表現(xiàn)，說(shuō)明高血糖是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)重要原因；糖尿病動(dòng)物模型存在高三酰甘油、高膽固醇、高低密度脂蛋白、高同型半胱氨酸及血果糖胺的升高；上述指標(biāo)的增高可能是糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素，其作用可能與內(nèi)皮細(xì)胞受損，動(dòng)脈壁局部炎癥介質(zhì)表達(dá)有關(guān)，但它們導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。

［1］ Morrish NJ，Wang SL，Stevens LK，etal.Mortality and causes of death in the WHO multinational study of vascular disease in diabetes［J］.Diabetologia，2001，44（suppl 2）：s14－s21.

［2］ Jeerakathil T，Johnson JA，Simpson SH，etal.Short－term risk for stroke is doubled in persons with newly treated type 2diabetes compared with persons without diabetes：A population based cohort study［J］.Stroke，2007，38：1739－1743.

［3］ Peter Libby.Current concepts of the pathogenesis of the acute coronary syndromes［J］.Circulation，2001，104：365－372.

［4］ Ross R.Atheroselerosis－an inflammatory disease［J］.N Engl J Med，1999，340：115－126.

［5］ Cannon C，Braunwald E，McCabe C，etal.Intensive versus moderate lipid lowering with stains after acute coronary syndromes［J］.N Engl J Med，2004，350：1495－1504.

［6］ Homocysteine Studies Collaboration.Ametaanalysis［J］.J Am Med Assoc，2002，288：2015－2022.