顧蓓喬，梅光明，喻 亮，張小軍，朱敬萍，李佩佩

（浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

浙江省是水產(chǎn)大省，2012年全省約540萬(wàn)t水產(chǎn)品產(chǎn)量，漁業(yè)經(jīng)濟(jì)總產(chǎn)值約1 600億。從我省較大規(guī)模的漁業(yè)生產(chǎn)總量和水產(chǎn)品消費(fèi)量來(lái)看，水產(chǎn)品質(zhì)量安全在我省顯得尤為重要。目前水產(chǎn)品中的一些常見禁用藥和限用藥使用問題已經(jīng)得到各級(jí)政府部分的有效監(jiān)管，加上漁民法律意識(shí)增強(qiáng)，這些漁藥已經(jīng)很少或不再使用。但是隨著生態(tài)環(huán)境的持續(xù)變化和養(yǎng)殖過程出現(xiàn)新的疫情，一些新品種的抗生素開始被推廣應(yīng)用起來(lái)，一些原先用在人類或其他動(dòng)物疾病防治中的抗生素也逐漸被用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中。頭孢菌素便是一種人畜共用的半廣譜抗生素，能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，具有高效和低毒優(yōu)點(diǎn)，自20世紀(jì)60年代到現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到第四代藥物。目前較多地被用于畜禽養(yǎng)殖中，但也逐漸用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1-3]。動(dòng)物服食藥物后，藥物在動(dòng)物的體內(nèi)累積或蓄存。研究表明長(zhǎng)期過量使用頭孢菌素會(huì)對(duì)人體健康帶來(lái)潛在的危害，而且影響深遠(yuǎn)，比如產(chǎn)生變態(tài)、過敏反應(yīng)或毒性損傷和泌尿系統(tǒng)損害等[4]，為此包括中國(guó)在內(nèi)的很多國(guó)家對(duì)頭孢菌素在牛肉、豬肉和牛奶等制品中的限量均進(jìn)行了規(guī)定，但都沒有包括水產(chǎn)品在內(nèi)。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)頭孢菌素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和方法主要有高效液相色譜法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-10]，也多集中在畜禽產(chǎn)品上，關(guān)于水產(chǎn)品中頭孢菌素殘留的檢測(cè)方法較少。為進(jìn)一步排查水產(chǎn)品中面臨的新的安全隱患問題，避免食用頭孢菌素超標(biāo)的水產(chǎn)品，本研究建立適用于水產(chǎn)品中頭孢菌素類殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定法，為水產(chǎn)品中頭孢菌素藥物殘留監(jiān)控工作提供了技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)使用的水產(chǎn)品均購(gòu)于浙江舟山市沈家門東河市場(chǎng)，洗凈、去皮、去鱗和去骨后，經(jīng)高速組織搗碎機(jī)均勻搗碎后作為檢測(cè)用樣品。

1.1.2 藥品與試劑

實(shí)驗(yàn)用水，應(yīng)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)一級(jí)水的要求；乙腈和甲醇（色譜純）；乙腈飽和正己烷：取250 mL分液漏斗在其中分別加入正己烷100 mL、乙腈50 mL，然后混合振蕩1 min，靜置直至分層，取上層；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：頭孢氨芐（CAS：16549-56-7）、頭孢噻呋（CAS：5575-21-3）、頭孢喹肟（CAS：118443-89-3），純度≥99%；1.0 mg/mL的頭孢菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱取適量的3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用蒸餾水進(jìn)行溶解和稀釋，儲(chǔ)備液貯存在-18℃冰柜中。

1.1.3 儀器設(shè)備

ACQUITYTM超高效液相色譜儀、QUATTRO Premier XE三重四極桿質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源，美國(guó)waters公司）；IKA T18基本型組織搗碎機(jī)（德國(guó)IKA公司）；MS2漩渦混合器（德國(guó)IKA公司）；Centrifuge 5810高速離心機(jī)（Eppendorf公司）；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上?？婆d儀器有限公司）；分析天平，感量0.1 mg和0.01 g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取

稱取5.0 g樣品（精確到0.01 g），置于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈渦旋振蕩2 min，10 000 r/min下離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，殘?jiān)屑尤?5 mL乙腈重復(fù)操作1次，合并2次提取液，加入10 mL乙腈飽和正己烷，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min下離心10 min，棄掉上層正己烷后把提取液轉(zhuǎn)移至100 mL雞心瓶中，40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，在雞心瓶中加入2 mL純水，使殘?jiān)浞秩芙猓^0.22 μm濾膜后供液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.2 液相色譜參考條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 rnm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：甲酸水溶液（0.1%）（A）+乙腈（B）；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相梯度洗脫流程見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫流程Tab.1 Gradient elution programme of mobile phase

1.2.3 三重四級(jí)桿質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；毛細(xì)管電壓：3.50 kV；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：380℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的掃描模式。反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 反應(yīng)監(jiān)測(cè)子離子、母離子和碰撞能量的選擇Tab.2 Reaction monitoring about ion,parent ion and collision energy,s selection

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

用純水稀釋3種頭孢菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到濃度分別為2.00、5.00、10.0、20.0、50.0和100 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液。三種頭孢菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1～3所示。結(jié)果表明3種頭孢菌素在2.00～100.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，其中頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定線性方程為y=7.844 51 x+2.416 39（r2=0.997），頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定線性方程為 y=135.459 x+72.089 9（r2=0.997），頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定線性方程為y=170.261 x+66.594 4（r2=0.998）。

圖4為50.0 μg/L的3種頭孢菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖。由圖可以看出，色譜峰形尖銳，信號(hào)響應(yīng)度強(qiáng)，頭孢噻呋，頭孢氨芐，頭孢喹肟出峰時(shí)間分別為1.18 min，2.98 min和1.43 min。

圖1 頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖Fig.1 Standard curve of Cephalexin

圖2 頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖Fig.2 Standard curve of Ceftiofur

圖3 頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖Fig.3 Standard curve of Cefquinome

圖4 50.0μg/L的3種頭孢菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of mixed standard solution(50.0 μg/L)

2.2 方法定量檢出限

空白草魚樣品通過添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后經(jīng)前處理、上機(jī)檢測(cè)分析，方法定量限（LOQ）為信噪比S/N=10的樣品濃度，計(jì)算出本方法中頭孢噻呋、頭孢氨芐和頭孢喹肟的LOQs分別為2.0、2.00和10.0 μg/kg，方法回收率均大于80%，由此可見本方法定量限較低，檢測(cè)靈敏度較高。10.0 μg/kg濃度加標(biāo)的樣品及空白草魚樣品色譜圖如圖5和圖6所示。

圖5 空白草魚試樣10.0 μg/kg加標(biāo)測(cè)定MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatogram of blank grass carp sample spiked with 10.0 μg/kg

圖6 空白草魚試樣MRM色譜圖Fig.6 MRM chromatogram of blank grass carp sample

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

在空白大黃魚和草魚樣品中按高、中、低3個(gè)加標(biāo)濃度下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液添加回收測(cè)定試驗(yàn)，計(jì)算平均回收率和平行測(cè)定結(jié)果RSD值，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知在3個(gè)不同加標(biāo)濃度下，頭孢氨芐平均回收率為76.7%～93.1%，頭孢喹肟平均回收率為80.5%～93.9%，頭孢噻呋平均回收率為78.9%～87.2%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于13%，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法回收率高、精密度好，可滿足水產(chǎn)品中頭孢菌素類藥物殘留量的檢測(cè)要求。

表3 空白試樣不同加標(biāo)濃度下的回收率和精密度（n=6）Tab.3 Results of recovery and precision of spiked samples(n=6)

3 結(jié)論

研究確立了水產(chǎn)品中頭孢菌素殘留量的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定的樣品前處理和分析測(cè)試條件，建立了合適的樣品前處理方法及色譜分離和質(zhì)譜測(cè)定條件。該方法簡(jiǎn)便快速，基體干擾小，線性范圍寬，回收率和檢出限滿足分析檢測(cè)要求，可以適用于水產(chǎn)品中該類藥物殘留監(jiān)控。

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