胡慶 楊麗軍 張山起

去竇弓神經(jīng)對大鼠血管內(nèi)皮功能的影響

胡慶 楊麗軍 張山起

目的 探討去竇弓神經(jīng)(SAD)對大鼠血管內(nèi)皮功能的影響。 方法 選取SD大鼠50只隨機(jī)分為對照組、假手術(shù)組、SAD 30 d組、SAD 60 d組、SAD 90 d組,分別采空腹靜脈血,測定血管內(nèi)皮功能指標(biāo):一氧化氮(NO)和內(nèi)皮素1(ET-1)的變化。 結(jié)果 假手術(shù)組血壓與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,3個SAD組與對照組比較24 h舒張壓和收縮壓波動明顯(P<0.05);SAD 30 d組、SAD 60 d組、SAD 90 d組與對照組及假手術(shù)組比較NO明顯減少(P<0.05),ET-1明顯增多(P<0.05);且大鼠隨SAD時間的延長，NO水平逐漸降低(P<0.05),ET-1水平逐漸升高(P<0.05)。 結(jié)論 SAD導(dǎo)致的血壓波動,使血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能遭到明顯破壞,且隨時間延長日益嚴(yán)重,血壓波動可能促進(jìn)動脈硬化的發(fā)生和發(fā)展。

去竇弓神經(jīng)； 大鼠; 血管內(nèi)皮; 一氧化氮; 內(nèi)皮素1

動脈壓力感受性反射的主要功能是維持血壓穩(wěn)定。切斷主動脈弓和頸動脈竇壓力感受器的傳入神經(jīng),稱為去竇弓神經(jīng)(sinoaortic denervation,SAD),SAD后大鼠血壓波動明顯[1]。隨喂養(yǎng)時間的延長，大鼠毛色逐漸失去光澤,精神日漸萎靡,對光、電刺激的反應(yīng)降低。本實驗的目的是探討SAD后大鼠空腹靜脈血中一氧化氮(NO)和內(nèi)皮素1(ET-1)的變化,進(jìn)而探討SAD對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2月齡SD大鼠50只,雌雄不限,體質(zhì)量200～250 g,購自河北醫(yī)科大學(xué)動物中心,隨機(jī)分為5組，每組10只:對照組,假手術(shù)組,SAD 30 d組、SAD 60 d組、SAD 90 d組。各組大鼠實驗前的血壓及血壓波動性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 SAD大鼠的制備和檢驗 SAD組大鼠用鹽酸氯胺酮50 mg/kg加地西泮5 mg/kg腹腔注射麻醉,同時腹腔注射硫酸阿托品0.5 mg/kg以抑制呼吸道腺體分泌。麻醉后大鼠仰臥位固定,頸部正中切開,分離雙側(cè)主動脈神經(jīng)并切斷,暴露頸動脈竇區(qū)并去除該區(qū)的神經(jīng)支配,用10%苯酚乙醇溶液涂擦,最后縫合切口。后肢肌內(nèi)注射青霉素鈉6×104U,完成整個SAD手術(shù)。術(shù)后3個SAD組分別飼養(yǎng)30 d、60 d、90 d。假手術(shù)組不作神經(jīng)分離和切除,其余步驟與SAD手術(shù)相同;對照組不做手術(shù)，正常飼養(yǎng)。

SAD大鼠實驗前檢驗:SAD大鼠麻醉后行股靜脈插管和經(jīng)股動脈的低位腹主動脈插管,24 h后在清醒自由活動狀態(tài)下，去氧腎上腺素(深圳沃蘭德藥業(yè))4 μg/kg,靜脈點滴,血壓升高≥50 mmHg,心率減慢<20次/min,則認(rèn)為SAD完全。實驗組全部合格。假手術(shù)組大鼠用去氧腎上腺素檢驗時,心率減慢60～100次/min。

1.3 清醒、自由活動大鼠的血壓監(jiān)測 術(shù)后30 d、60 d、90 d測量5組大鼠血壓,假手術(shù)組和對照組在3個時間點分別測量3只、3只、4只。在大鼠一側(cè)腹股溝處切開,分離股動脈和靜脈,用肝素化的聚乙烯導(dǎo)管分別進(jìn)行動脈插管和靜脈插管。插管另一端用引針經(jīng)背部皮下至頂部穿出,用“馬鞍”固定,術(shù)后大鼠置于隔音實驗室內(nèi)單獨飼養(yǎng)?；謴?fù)24 h后置于有機(jī)玻璃圓筒內(nèi),動脈導(dǎo)管經(jīng)轉(zhuǎn)動裝置和灌注三通管與壓力換能器連接,灌注三通管與恒速推注泵連接,1 ml/h推注20 IU/ml肝素化等滲葡萄糖溶液。每搏血壓信號經(jīng)壓力換能器轉(zhuǎn)換為電信號,由分析系統(tǒng)(成都泰盟BL-420)實時記錄并處理收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)。以每搏血壓為基礎(chǔ),計算每個動物在24 h內(nèi)SBP、DBP的均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差,標(biāo)準(zhǔn)差表示血壓波動性(BPV)。分別計算24 h 收縮壓波動性(SBPV)及舒張壓波動性(DBPV)。假手術(shù)組和對照組大鼠3個時間點的血壓及波動性無差異,因此放在一起處理。

1.4 靜脈血采集及指標(biāo)檢測 分別于SAD術(shù)后30 d、60 d、90 d尾靜脈取血5 ml，加入含0.2 ml 2%EDTA的抗凝管中，于4 ℃低溫離心機(jī)3000 r/min離心10 min，分離血漿，分裝后置于-80 ℃冰箱冷凍待測。采用硝酸還原酶法測定NO，試劑盒購自衡水德安試劑有限公司。采用放射免疫法測定ET-1，試劑盒購自南京建成生物技術(shù)研究所。操作方法嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行，各項質(zhì)量控制指標(biāo)均符合要求。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠動脈血壓及血壓波動性比較 于30 d、60 d、90 d后,假手術(shù)組與對照組比較,24 h平均SBP和DBP以及SBP和DBP波動性無差異;SAD組與對照組比較,24h SBP和DBP波動性均顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組24 h動脈血壓及血壓波動性變化比較

注:與對照組比較,*P<0.05

2.2 各組大鼠空腹靜脈血NO和ET-1的變化 假手術(shù)組與對照組NO和ET-1比較均無變化;SAD術(shù)后30 d、60 d、90 d組與對照組比較,NO明顯減少(P<0.05),ET-1明顯增加(P<0.05),且隨著術(shù)后時間的延長,NO逐漸減少(P<0.05),ET-1逐漸增加(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血NO和ET-1水平變化比較

注:與對照組比較,*P<0.05;與SAD 30 d組比較,△P<0.05;與SAD 60 d組比較,#P<0.05

3 討論

BPV是血壓最基本的生理特征之一,然而BPV長期增大會導(dǎo)致靶器官損傷,BPV受諸多因素的影響,其中動脈壓力感受器是最關(guān)鍵的因素。本實驗表明,大鼠去除壓力感受器反射后,24 h平均血壓并不增高,BPV明顯增高;術(shù)后30 d血漿NO和ET-1發(fā)生明顯變化,提示血管內(nèi)皮功能受到明顯損傷。血管內(nèi)皮功能損傷是動脈粥樣硬化的始動因素[2],血管內(nèi)皮細(xì)胞通過分泌多種血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)血管緊張度、血液流變學(xué)以及細(xì)胞對血管壁的黏附。NO和ET-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的相互拮抗的血管活性物質(zhì),在調(diào)節(jié)和維持血管舒縮功能方面發(fā)揮重要作用[3]。

NO是最主要的舒血管因子,而ET-1是迄今已知的最強(qiáng)的縮血管因子。正常情況下,內(nèi)源性激動劑能刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ET-1,而ET-1又刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO來對抗ET-1的血管收縮效應(yīng),因此ET-1與NO的動態(tài)平衡對維持血管正常舒縮功能具有重要意義[4]。

本實驗提示,血壓波動導(dǎo)致血管頻繁舒張及收縮,使血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能受到損害,分泌NO的能力下降,相反ET-1產(chǎn)生增多[5]。NO和ET-1失去平衡,使血管內(nèi)皮的功能日益減弱。NO減少可導(dǎo)致:(1)cGMP依賴性蛋白激酶活性下降,減少胞漿內(nèi)鈣離子向胞外流動或貯存于胞內(nèi)鈣離子庫中,抑制鈣離子內(nèi)流的作用減弱,使胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度增高,導(dǎo)致血管平滑肌收縮,血流量減少。(2)將積存在血管壁上的脂肪、膽固醇帶走的作用減弱,不能及時清除血管內(nèi)壁復(fù)合物[6]。ET-1除有收縮血管作用外,也可以作為單核細(xì)胞趨化劑,誘導(dǎo)單核細(xì)胞向血管內(nèi)膜層移行、活化并刺激多種細(xì)胞因子釋放,刺激血管平滑肌細(xì)胞的移行和增生,從而促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[7]。

本實驗通過檢測SAD大鼠空腹靜脈血NO和ET-1,發(fā)現(xiàn)血壓波動引起NO合成減少,使內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ET-1逐漸增多且隨著時間的推移日益嚴(yán)重。說明SAD導(dǎo)致的血壓明顯波動能加速動脈硬化的進(jìn)程,對心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展有一定影響。

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Effects of sinoaortic denervation on vascular endothelial function of rats

HUQing.DepartmentofPhysiology,CangzhouMedicalCollege,Cangzhou061000,China;YANGLi-jun.

DepartmentofNeuralInternalMedicine,CangzhouCentralHospital,Cangzhou061000,China;ZHANGShan-qi.DepartmentofBiochemistry,CangzhouTechnicalCollege,Cangzhou061001,China.

Objective To explore the effects of sinoaortic denervation(SAD) on vascular endothelial function of rats. Methods Fifty SD rats were randomly divided into five groups: control group,sham operation group,30-day SAD group, 60-day SAD group and 90-day SAD group. Nitric oxide(NO) and endothelin 1(ET-1) were measured and compared between the five groups. Results There were no differences in blood pressure between the sham operation group and the control group. Compared with the control group, both systolic blood pressure and diastolic blood pressure in three SAD groups fluctuated obviously within 24 hours(P<0.05). The level of NO was depressed significantly(P<0.05) and the level of ET-1 was elevated significantly(P<0.05) in the three SAD groups compared with that in the control group and sham operation group. And in the three SAD groups, the level of NO(P<0.05) was gradually decreased and the level of ET-1(P<0.05) was gradually increased. Conclusions The fluctuation of blood pressure caused by sinoaortic denervation might destroy the function of endothelial cells obviously at a time-dependent manner. So the fluctuation of blood pressure can promote the occurrence and development of atherosclerosis.

sinoaortic denervation; Wistar rats; vascular endothelial; nitric oxide; endothelin 1

滄州市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃項目(1123077ZD)

061001河北省滄州市，滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生理教研室(胡慶)；061000河北省滄州市，滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科(楊麗軍)；061000河北省滄州市，滄州市職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)教研室(張山起)

楊麗軍，Email：czyzhq@126.com

R 338.1

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.05.016

2014-06-12)