廖亞平 張 鼎 周 偉 劉長(zhǎng)青 董淮富

(蚌埠醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030)

亞甲基四氫葉酸還原酶和胱硫醚-β-合成酶基因多態(tài)與唐氏綜合征發(fā)生的關(guān)系

廖亞平 張 鼎 周 偉 劉長(zhǎng)青 董淮富1

(蚌埠醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030)

目的 探討母體5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因和胱硫醚-β-合成酶(CβS)基因多態(tài)性與唐氏綜合征(DS)發(fā)生的關(guān)系。方法 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測(cè)70例DS患兒母親和117例對(duì)照女性的MTHFR 兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(C677T、A1298C)，利用SHEsis在線分析軟件進(jìn)行單體型和連鎖不平衡分析；PCR法檢測(cè)CβS 844Ins68基因型。Pearson χ2 檢驗(yàn)各基因和基因型頻率分布的差異。計(jì)算比值比評(píng)價(jià)相對(duì)危險(xiǎn)度。結(jié)果 MTHFR基因兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)及CβS 844Ins68突變基因頻率和基因型頻率在病例組和對(duì)照組中分布無(wú)顯著差異(P>0.05)。MTHFR 677T/T / 1298(C/C+C/A)聯(lián)合基因型顯著地增加DS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(OR=8.46，95%CI：0.90～79.51，P<0.05)。MTHFR 兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)存在連鎖不平衡(D′=0.68)；677T-1298C單體型與DS發(fā)生顯著相關(guān)(OR=5.22，95%CI：1.37～19.94，P<0.01)。結(jié)論 MTHFR兩個(gè)位點(diǎn)變異聯(lián)合分析及677T-1298C單體型可能是DS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素，不能排除葉酸代謝酶基因多態(tài)在DS發(fā)生中的作用。

唐氏綜合征；5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶；胱硫醚-β-合成酶；基因多態(tài)性

唐氏綜合征(DS)又稱21三體綜合征，主要表現(xiàn)為智力低下和發(fā)育遲緩，該征病因明確，但誘發(fā)因素和發(fā)病機(jī)制仍不清楚。女性高齡生產(chǎn)是該病較為明確的風(fēng)險(xiǎn)因素，但超過(guò)80%的DS患兒母親年齡<35歲。近年一些研究顯示母體葉酸缺乏及葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)可能與DS的發(fā)生相關(guān)〔1，2〕。5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，其基因編碼區(qū)存在2個(gè)常見單核苷酸多態(tài)(C677T、A1298C)。這兩個(gè)位點(diǎn)的變異可影響葉酸代謝和DNA甲基化。目前，葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)與DS發(fā)生的關(guān)系國(guó)內(nèi)外報(bào)道不一〔1，3～7〕。MTHFR基因單體型及胱硫醚-β-合成酶(CβS)基因844位插入一個(gè)68 bp的多態(tài)性片段(844Ins68)與DS發(fā)生的關(guān)系國(guó)內(nèi)未見報(bào)道。本研究以安徽蚌埠地區(qū)漢族人群為研究對(duì)象，探討母源MTHFR基因C677T和A1298C位點(diǎn)及CβS 844Ins68多態(tài)與DS發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集安徽蚌埠地區(qū)曾生育DS患兒的母親血樣70份，年齡19～45歲，漢族，相互間沒有血緣關(guān)系，染色體核型分析正常。正常對(duì)照血樣117份，與病例母親生活環(huán)境相同，年齡在22～45歲，未曾生育DS患兒且沒有不良妊娠史，無(wú)糖尿病、冠心病和高血壓等病史。

1.2 試劑與方法

1.2.1 DNA提取，目的片段PCR擴(kuò)增 無(wú)菌采集外周靜脈血4 ml，EDTA抗凝，-20℃保存。柱式全血基因組DNA抽提試劑盒提取DNA。基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自MBI Fermentas試劑公司。操作按說(shuō)明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增引物：MTHFR A1298C正義引物：5′-CTTTGGGGAGCTGGACTACTAC-3′，正義引物：5′-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3′；MTHFR C677T正義引物：5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′，正義引物：5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′；CβS 844Ins68正義引物：5′-CTGGCCTTGAGCCCTGAA-3′，正義引物：5′-GGCCGGGCTCTGGACTC-3′。

引物由上海Sangon公司合成。PCR擴(kuò)增體系含10倍緩沖液2.5 μl，dNTPs 2.5 μl(2 mmol/L)，MgCl22 μl(終濃度1.5 mmol/L)，正、反義游引物各0.5 μl(10 pmol/μl)，Taq酶0.5 μl(2 U /μl)，DNA 1 μl(約100 mg)，總體積25 μl。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，MTHFR A1298C、C677T和CβS 844Ins68分別退火60 s、63 s和59 s，延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 PCR-RFLP分析 限制性核酸內(nèi)切酶Hinf Ⅰ 、MboⅡ購(gòu)自MBI Fermentas試劑公司。將PCR產(chǎn)物純化后酶切，酶切反應(yīng)體系30 μl，包括PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，限制性核酸內(nèi)切酶10 U，緩沖液2 μl，ddH2O 17 μl。反應(yīng)體系在37℃水浴鍋中溫浴10 h，經(jīng)3%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳分析，紫外凝膠成像儀下觀察帶型并攝像，根據(jù)帶型判讀基因型，隨機(jī)選取各基因型測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)確認(rèn)研究樣本的群體代表性。采用Pearsonχ2檢驗(yàn)比較病例組與對(duì)照組基因型、基因頻率和各基因聯(lián)合基因型分布，必要時(shí)采用Fisher精確概率檢驗(yàn)。計(jì)算比值比(ORs)評(píng)價(jià)相對(duì)危險(xiǎn)度。單體型(haplotype)和連鎖不平衡分析采用SHEsis軟件采用SPSS17.0軟件。

2 結(jié) 果

2.1 MTHFR C677T、A1298C和CβS 844Ins68多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè) MTHFR C677T目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物198 bp，Hinf I酶切后純合突變型T/T為175、23 bp，雜合基因型C/T為198、175、23bp，野生基因型C/C為198bp(圖1)。MTHFR A1298C目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物163 bp，MboⅡ酶切后產(chǎn)生56、31、30、28、18 bp片段為A/A基因型，84、56、31、30、28、18 bp為A/C基因型，84、31、30、28 bp為C/C基因型(圖2)。CβS目的片段擴(kuò)增242 bp為844 Ins68純合子，出現(xiàn)242、174 bp兩個(gè)片段為雜合子，只有174 bp片段為未插入基因型純合子(圖3)。

1：C/C基因型；2，3～5：C/T基因型；4：T/T基因型

1，3，4，6，7：A/A基因型；2：A/C基因型；5：C/C基因型；M：Low MW DNA 標(biāo)準(zhǔn)

M：100 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)；1～3，5～7：Ins-/Ins-基因型；4：Ins+/Ins-基因型

2.2 MTHFR C677T、A1298C和CβS 844Ins68等位基因和基因型頻率的分布 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)病例組和對(duì)照組各基因型達(dá)到遺傳平衡(P>0.05)，具有群體代表性。病例組 MTHFR 677T 和1298C 等位基因頻率均高于對(duì)照組，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)顯著性水平(P>0.05)。CβS 844Ins68等位基因頻率在兩組中分別為0.7%和0.4%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)差異無(wú)顯著性(表1)。MTHFR C677T、A1298C和CβS 844Ins68 各基因型頻率在兩組間分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。見圖1～圖3。兩組均未檢出CβS 844Ins68 突變純合子，在中國(guó)人群中該插入頻率較低。

2.3 聯(lián)合基因型分析與單體型分析 分析存在的聯(lián)合基因型分布，評(píng)價(jià)潛在的基因與基因之間及相同基因不同多態(tài)位點(diǎn)的相互作用。MTHFR 677(T/T)/ 1298(C/C+A/C)聯(lián)合基因型顯著地增加DS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(OR=8.46，95%CI：0.90～79.51，P<0.05)(表2)。單體型分析顯示，MTHFR C677T、A1298C 存在較緊密連鎖不平衡(D′=0.68)，該調(diào)查人群中存在MTHFR 677T-1298C 單體型，該單體型與DS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(OR=5.22，95%CI：1.37～19.94，P<0.01)(表3)。其他相關(guān)基因型的交互作用與DS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 MTHFR A1298C、C677T和CβS 844Ins68基因型、等位基因頻率及分布〔n(%)〕

表2 兩組MTHFR兩個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合基因型的相互作用〔n(%)〕

表3 兩組MTHFR C677T 和 A1298C單體型分析(%)

3 討 論

女性年齡的增大可能導(dǎo)致其體內(nèi)紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)等保障染色體精確分離的功能被“磨損”削弱而最終導(dǎo)致染色體分離異常，然而多數(shù)DS患兒母親較年輕，提示可能存在其他的易感因素〔2，8，9〕。葉酸缺乏及代謝障礙可影響DNA甲基化，使DNA鏈不穩(wěn)定，引起DNA鏈斷裂、染色體重排和不分離〔9〕。葉酸代謝相關(guān)基因變異可能導(dǎo)致葉酸代謝障礙和葉酸功能性缺乏有關(guān)。

MTHFR基因存在2個(gè)常見多態(tài)位點(diǎn)，MTHFR C677T多態(tài)性可產(chǎn)生不耐熱的突變體而導(dǎo)致酶活性下降，進(jìn)而引起血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平上升，葉酸及一碳單位代謝障礙〔1〕。MTHFR基因的另一個(gè)常見突變位點(diǎn)為A1298C并產(chǎn)生了一個(gè)MboⅡ酶切位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)編碼的谷氨酸被丙氨酸替代。該位點(diǎn)同樣可以影響酶的活性，特別是與C677T多態(tài)位點(diǎn)合并分析時(shí)。James等〔1〕提出：MTHFR酶活性降低，可影響葉酸和一碳單位代謝，導(dǎo)致DNA低甲基化，是DS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素。而相關(guān)研究顯示MTHFR C677T和A1298C多態(tài)性與DS發(fā)生的關(guān)系尚存在爭(zhēng)議〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR A1298C位點(diǎn)變異在安徽皖北人群中頻率較C677T多態(tài)頻率低，和國(guó)內(nèi)相關(guān)研究相符〔4，11〕；本文病例組 C677T 和A1298C 變異基因頻率和基因型頻率均高于對(duì)照組，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)顯著性水平，但MTHFR 677(T/T)/ 1298(C/C+ A/C)聯(lián)合基因型與DS發(fā)生顯著相關(guān)，與王文等〔4〕研究相符。

本文顯示無(wú)論在病例組還是對(duì)照組，T-A單體型呈現(xiàn)強(qiáng)連鎖，而T-C頻率較低，說(shuō)明人群中存在對(duì)T-C單體型的負(fù)性選擇〔12，13〕。來(lái)自巴西、意大利等地的多項(xiàng)研究肯定了該基因2個(gè)位點(diǎn)的相互作用并認(rèn)為是DS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素〔14，15〕，該結(jié)果也在本研究中得到證實(shí)。最近，Wu等〔16〕Meta分析亦支持MTHFR多態(tài)與DS的發(fā)生相關(guān)。

CβS是Hcy代謝的一種關(guān)鍵酶，催化Hcy轉(zhuǎn)變?yōu)殡琢蛎选；蜃儺惪梢鹈富钚愿淖儚亩绊懷獫{Hcy水平。CβS基因第8外顯子第844 位存在68 bp 片段的插入(844ins68)，該插入導(dǎo)致了酶蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的改變，進(jìn)而降低了酶活性。目前認(rèn)為該插入突變與先天性心臟病、神經(jīng)管缺陷和唇腭裂有關(guān)。21三體胎兒含有3份CβS基因，導(dǎo)致體內(nèi)Hcy水平下降形成所謂的“甲基葉酸陷阱”和功能性葉酸缺乏可能導(dǎo)致胚胎的難以存活〔17〕。母體CβS 基因變異導(dǎo)致血漿總Hcy水平增高可能是維持21三體胎兒存活而免于流產(chǎn)的一個(gè)原因。本研究未發(fā)現(xiàn)CβS 844ins68多態(tài)與DS的發(fā)生相關(guān)，與Scala等〔14〕和Fintelman-Rodrigues等〔18〕研究相符。本組資料顯示CβS 844ins68發(fā)生頻率相當(dāng)?shù)?，未發(fā)現(xiàn)純合插入突變，與美國(guó)、意大利和巴西人群存在差異，和國(guó)內(nèi)報(bào)道的相符〔14，18～20〕。

綜上所述，雖然葉酸代謝與DS發(fā)生關(guān)系尚存一定爭(zhēng)議，本研究結(jié)果表明不能排除中國(guó)人群葉酸代謝相關(guān)基因特別是MTHFR基因突變?cè)贒S發(fā)生中的作用。進(jìn)一步研究應(yīng)獲取葉酸代謝異常、甲基化障礙而導(dǎo)致卵母細(xì)胞21號(hào)染色體不分離的直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)，以解釋流行病學(xué)的研究結(jié)果。

1 James SJ，Pogribna M，Pogribny IP，etal.Abnormal folate metabolism and mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene may be maternal risk factorsfor Down syndrome〔J〕.Am J Clin Nutr，1999；70(4)：495-501.

2 Coppedè F，Migheli F，Bargagna S，etal.Association of maternal polymorphisms in folate metabolizing genes with chromosome damage and risk of Down syndrome offspring〔J〕.Neurosci Lett，2009；449(1)：15-9.

3 梁 蓉，郁衛(wèi)東，杜軍保，等.葉酸代謝相關(guān)酶基因多態(tài)性與唐氏綜合征發(fā)生易感性的關(guān)系〔J〕.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2006；22(12)：1372-5.

4 王 文，劉福民，嚴(yán)曉南，等.葉酸代謝相關(guān)基因的多態(tài)性與唐氏綜合征的關(guān)系〔J〕.中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2009；12(2)：93-7.

5 Wang SS，Qiao FY，F(xiàn)eng L，etal.Polymorphisms in genes involved in folate metabolism as maternal risk factors for Down syndrome in China〔J〕.J Zhejiang Univ Sci B，2008；9(2)：93-9.

6 Coppedè F，Grossi E，Migheli F，etal.Polymorphisms in folate-metabolizing genes，chromosome damage，and risk of Down syndrome in Italian women：identification of key factors using artificial neural networks〔J〕.BMC Med Genomics，2010；3：42-51.

7 廖亞平，鮑明升，劉長(zhǎng)青，等.年輕母親葉酸代謝基因多態(tài)性與唐氏綜合征發(fā)生的關(guān)系〔J〕.遺傳，2010；32(5)：461-6.

8 史慶華，許 波，楊慶嶺，等.非整倍體和人類生殖健康〔J〕.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008；38(8)：388-94.

9 Wang X，Thomas P，Xue J，etal.Folate deficiency induces aneuploidy in human lymphocytes in vitro-evidenceusing cytokinesis-blocked cells and probes specific for chromosomes 17 and 21〔J〕.Mutat Res，2004；551(1-2)：167-80.

10 Coppedè F.The complex relationship between folate/homocysteine metabolism and risk of Down syndrome〔J〕.Mutat Res，2009；682(1)：54-70.

11 張海洋，張金華，張會(huì)敏.MTHFR基因多態(tài)性與腦卒中的相關(guān)性〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2012；32(4)：690-1.

12 孫耀峰，戴宇飛，程 娟，等.亞甲基四氫葉酸還原酶基因單體型與焦?fàn)t作業(yè)工人染色體損傷易感性的關(guān)系〔J〕.衛(wèi)生研究，2006；35(4)：387-9.

13 Biselli JM，Goloni-Bertollo EM，Zampieri BL，etal.Genetic polymorphisms involved in folate metabolism and elevated plasma concentrations of homocysteine：maternal risk factors for Down syndrome in Brazil〔J〕.Genet Mol Res，2008；7(1)：33-42.

14 Scala I，Granese B，Sellitto M，etal.Analysis of seven maternal polymorphisms of genes involved in homocysteine/folate metabolism and risk of Down syndrome offspring〔J〕.Genet Med，2006；8(7)：409-16.

15 Brandalize AP，Bandinelli E，Dos Santos PA，etal.Maternal gene polymorphisms involved in folate metabolism as risk factors for Down syndrome offspring in Southern Brazil〔J〕.Dis Markers，2010；29(2)：95-101.

16 Wu X，Wang X，Chan Y，etal.Folate metabolism gene polymorphisms MTHFR C677T and A1298C and risk for Down syndrome offspring：a meta-analysis〔J〕.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2013；167(2)：154-9.

17 Martinez-Frias ML，Perez B，Desviat LR，etal.Maternal polymorphisms 677C-T and 1298A-C of MTHFR，and 66A-G MTRR genes：is there any relationship between polymorphisms of the folate pathway，maternal homocysteine levels，and the risk for having a child with Down syndrome〔J〕? Am J Med Genet A，2006；140(9)：987-97.

18 Fintelman-Rodrigues N，Corrêa JC，Santos JM，etal.Investigation of CΒS，MTR，RFC-1 and TC polymorphisms as maternal risk factors for Down syndrome〔J〕.Dis Markers，2009；26(4)：155-61.

19 朱文麗，宋曉明，李孟憶，等.CBS 基因變異與血清同型半胱氨酸水平及先天性心臟病的關(guān)系研究〔J〕.衛(wèi)生研究，2008；37(4)：463-7.

20 劉 斌，田 冉，高 端，等.同型半胱氨酸代謝酶MTHFR、CΒS、MS基因多態(tài)性與腦梗死患者頸動(dòng)脈狹窄的相關(guān)性〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2011；21(33)：4013-8.

〔2013-09-17修回〕

(編輯 趙慧玲/曹夢(mèng)園)

安徽省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(1208085QC67)；蚌埠醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目(BY1019)

廖亞平(1977-)，男，副教授，碩士，主要從事非整倍體疾病研究。

R394

A

1005-9202(2015)12-3370-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.086

1 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科