張彥榮 高 翔 畢 偉

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血管外科，河北 石家莊 050000)

氨基胍對(duì)大鼠骨骼肌缺血再灌注肺損傷一氧化氮合酶表達(dá)的影響

張彥榮 高 翔 畢 偉

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血管外科，河北 石家莊 050000)

目的 觀察骨骼肌缺血再灌注(I/R)肺損傷誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)及一氧化氮(NO)變化情況，探討氨基胍(AG)及NO在骨骼肌I/R肺損傷中的作用機(jī)制。方法 將24只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為四組，對(duì)照組，僅進(jìn)行常規(guī)麻醉，不阻斷后肢血流；缺血組，即缺血4 h無(wú)再灌注組；I/R組，即缺血4 h后再灌注6 h；I/R+AG治療組，即缺血4 h后繼續(xù)再灌注6 h，并于再灌注開(kāi)始時(shí)經(jīng)尾靜脈注射AG(150 mg/kg)。檢測(cè)血清中乳酸脫氫酶(LDH)、NO含量、肺組織中丙二醛(MDA)含量及iNOS基因在肺組織中的表達(dá)情況。結(jié)果 iNOS表達(dá)對(duì)照組不明顯；在缺血、IR組呈上升趨勢(shì)；I/R+AG組表達(dá)下調(diào)；與對(duì)照組比較，其余三組差異顯著(P<0.05)；I/R+AG組與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。LDH、NO、MDA含量：缺血、I/R組逐漸升高(P<0.05)；I/R+AG組相應(yīng)下降，與I/R組比較差異顯著(P<0.05)。結(jié)論 在骨骼肌I/R后肺組織中iNOS、血清中的NO均明顯升高，AG可明顯抑制iNOS表達(dá)上調(diào)，降低NO、LDH、MDA含量，通過(guò)抑制iNOS降低NO含量，減少肺損傷。

氨基胍；再灌注損傷；骨骼??；肺損傷；一氧化氮合酶

肢體缺血再灌注(I/R)損傷臨床上常見(jiàn)于肢體擠壓傷及急性肢體動(dòng)脈栓塞再通后，嚴(yán)重缺血的肢體再灌注后可引發(fā)遠(yuǎn)隔臟器損傷，其中腎損傷在臨床上較為多見(jiàn)，其次為肺損傷，嚴(yán)重影響治療效果。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)是催化合成內(nèi)源性一氧化氮(NO)的酶，高濃度NO可造成組織損傷，在腦I/R損傷中NO的作用已被肯定〔1〕。氨基胍(AG)是iNOS的抑制劑，主要通過(guò)抑制iNOS的活性而起作用〔2〕，本實(shí)驗(yàn)觀察iNOS表達(dá)、NO含量變化及肺組織損傷情況，進(jìn)一步闡明骨骼肌I/R肺損傷作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑 AG 購(gòu)自Sigma公司，iNOS免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司，NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物工程有限公司，RNA提取試劑(Trizol reagent)為Invitrogen公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、核糖核酸酶抑制劑(RNasin)、dNTP、Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)、隨機(jī)引物(random primers)及瓊脂糖(agarose)均為美國(guó)Promega 公司產(chǎn)品；熒光定量試劑盒〔hot start fluorescent PCR core reagent kits(SYBR Green I)〕購(gòu)自BBI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性Wistar大鼠24只，體重200 g左右，由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將24只大鼠隨機(jī)分為四組，每組6只，對(duì)照組，僅進(jìn)行常規(guī)麻醉，不阻斷后肢血流(10 h后取材)；缺血組，即阻斷后肢動(dòng)脈致缺血4 h不行再灌注組；缺血再灌注(I/R)組，即阻斷后肢動(dòng)脈致缺血4 h再灌注6 h；I/R+AG組，即阻斷后肢動(dòng)脈致缺血4 h再灌注6 h，再灌注開(kāi)始時(shí)經(jīng)尾靜脈注射AG注射液(150 mg/kg)〔3〕。

1.3 模型制備 20%烏拉坦(5 ml/kg)腹腔注射麻醉，止血帶捆扎兩側(cè)大腿根部，使兩后肢缺血4 h后去除止血帶實(shí)現(xiàn)再灌注〔4〕，各組設(shè)定時(shí)間處理動(dòng)物，分別取材。

1.4 檢測(cè)項(xiàng)目及方法

1.4.1 乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮(NO)與丙二醛(MDA)檢測(cè) 各組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)經(jīng)心臟穿刺取血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清LDH含量，用Bio Tek ELX800酶標(biāo)儀嚴(yán)格按照NO檢測(cè)試劑盒進(jìn)行NO檢測(cè)，取肺組織勻漿并用硫代巴比妥酸法檢測(cè)肺組織中MDA含量。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肺臟iNOS表達(dá) 對(duì)四組大鼠肺組織進(jìn)行免疫組化染色。肺泡上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。iNOS陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)〔5〕。計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野，按照染色強(qiáng)度計(jì)分：0分為無(wú)著色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，≤10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>76%計(jì)4分；二者計(jì)分相乘0～2分為(-)，≥3分為(+)。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 用RT-PCR法檢測(cè)四組肺組織iNOS基因的相對(duì)表達(dá)量。分別于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)處死動(dòng)物后，取肺組織-80℃保存?zhèn)溆?。Trizol一步法提取肺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用染料法(syber green I)進(jìn)行熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參照基因，與對(duì)照組相比，得目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所用引物系列如下：GAPDH 上游引物為5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游引物為5′-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3′； iNOS上游引物為5′-CTTGGAGCGAGTTGTGGATTG-3′，下游引物為5′-GCCTCTTGTCTTTGACCCAGTA-3′。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清LDH、NO及肺組織MDA含量 缺血組LDH、NO、MDA均較對(duì)照組升高(P<0.05)，I/R組較缺血組升高更為明顯(P<0.05)，IR+AG治療組均較缺血組高，而顯著低于I/R組(P<0.05)(表1)。

2.2 各組大鼠肺組織HE染色 對(duì)照組正常肺泡上皮細(xì)胞；缺血組肺泡間隔增寬，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；I/R組肺泡間隔明顯增寬，結(jié)構(gòu)破壞，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；I/R+AG治療組肺泡間隔增寬程度明顯減輕，充血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)較I/R組改善明顯。見(jiàn)圖1。

2.3 各組大鼠肺組織iNOS表達(dá) 對(duì)照組肺泡上皮細(xì)胞未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)；缺血組肺泡上皮細(xì)胞呈淡黃色顆粒狀；I/R組肺泡上皮細(xì)胞見(jiàn)棕褐色顆粒，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；I/R+AG治療組陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)明顯減輕。見(jiàn)圖2。對(duì)照組肺組織iNOS表達(dá)很低(0.91±0.14)，缺血組開(kāi)始上調(diào)(5.73±1.25)，I/R組iNOS的表達(dá)明顯上調(diào)(15.13±2.33)，而I/R+AG組可見(jiàn)iNOS表達(dá)顯著下調(diào)(9.78±2.33)。

表1 各組大鼠血清LDH、NO及肺組織MDA含量

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與I/R組比較：2)P<0.05

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化(HE，200×)

圖2 各組大鼠肺組織iNOS表達(dá)(SP，200×)

3 討 論

骨骼肌I/R損傷的早期，氧自由基、炎性因子的作用是導(dǎo)致I/R損傷的主要原因〔6〕。LDH是骨骼肌損傷的標(biāo)志性酶，可反映出骨骼肌損傷的程度，氧自由基通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化作用介導(dǎo)組織細(xì)胞的損害，近來(lái)發(fā)現(xiàn)再灌注心肌線粒體膜成分明顯改變，心磷脂顯著減少，并與MDA產(chǎn)生相關(guān)脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)作為自由基產(chǎn)生系統(tǒng)，與I/R誘導(dǎo)的組織損傷關(guān)系密切，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化率的一重要指標(biāo)，MDA水平是間接反映自由基大量產(chǎn)生的可靠指標(biāo)〔7〕，骨骼肌I/R肺損傷時(shí)可產(chǎn)生大量的過(guò)氧化物和超氧自由基，激活核因子-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，造成細(xì)胞因子、黏附分子及炎癥反應(yīng)的酶類(iNOS)過(guò)度表達(dá)，這些物質(zhì)直接或間接地參與了I/R損傷〔8〕。左旋精氨酸在NOS的催化下合成NO，缺血再灌注過(guò)程中，iNOS表達(dá)明顯上調(diào)，使NO產(chǎn)生增多，與活性氧自由基反應(yīng)生成具有細(xì)胞毒性的超氧亞硝酸離子(ONOO-)，對(duì)組織器官造成損害。以往的研究認(rèn)為，AG的作用是使iNOS活性降低，進(jìn)而減少氧自由基的產(chǎn)生〔9〕，但本研究觀察到iNOS于I/R組較其他三組在肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯增強(qiáng)，基因水平亦有顯著升高，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中AG除抑制iNOS的活性還降低了它的生成量，結(jié)合病理組織學(xué)表現(xiàn)，表明iNOS與組織損傷程度相關(guān)，據(jù)此推測(cè)，iNOS-NO-ONOOˉ途徑可能介導(dǎo)了骨骼肌I/R肺損傷，肺組織中MDA在I/R組明顯高于對(duì)照及缺血組，而治療組又顯著下降，正是炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及ONOOˉ介導(dǎo)過(guò)氧化損傷的結(jié)果。AG較有效地阻止了iNOS對(duì)NO產(chǎn)生的催化作用，對(duì)I/R肺損傷具有明顯的保護(hù)作用。

1 張會(huì)欣，張建新，李蘭芳，等.一氧化氮合酶抑制劑氨基胍對(duì)腦缺血大鼠腦組織氨基酸含量的影響〔J〕.中國(guó)病理生理雜志，2005；21(2)：342-6.

2 Hang HX，Zhang JX，Li LF，etal.Mechanism of protective effect of aminoguanidine on experimental cerebral ischemic injury in rats〔J〕. Chin J Pharmacol Toxic，2006；20(4)：281-7.

3 王文安，王根發(fā)，周永煒，等.氨基胍對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷及血腦屏障的影響〔J〕.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2006；26(7)：755-7.

4 張連元，楊 林.生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)教程〔M〕.北京：人民軍醫(yī)出版社，2001：29-30.

5 許良中，楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)〔J〕.中國(guó)癌癥雜志，1996；6(4)：229-31.

6 Scckamp A，Mulligan MS，Till G，etal.Role of β2-integrins and ICAM-1 in lung injury following ischemia-reperfusion of rat hind limbs〔J〕.Am J Pathol，1993；143(2)：464.

7 Orhan Gokalp，Ismail Yurekli，Muge Kiray，etal.Assessment of protective effects of pheniramine maleate on reperfusion injury in lung after distant organ ischemia：a rat model〔J〕.Vasc Endovasc Surg，2013；47(3):219-24.

8 Shih HC，Huang MS，Lee CH.Magnolol attenuates the lung injury in hypertonic saline treatment from mesenteric ischemia reperfusion through diminishing iNOS〔J〕.J Surg Res，2012;175(2)：305-11.

9 王露茜，賈 靜，郭明發(fā)，等.L-精氨酸、氨基胍和瓜丁胺在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用〔J〕.中國(guó)病理生理雜志，2011;27(6):1213-7.

〔2014-06-10修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢(mèng)園)

畢 偉(1964-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事外周血管疾病研究。

張彥榮(1967-)，女，主任醫(yī)師，博士，主要從事外周血管疾病研究。

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A

1005-9202(2015)12-3269-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.036