王 丹 李 紅 白云生 于春艷 陳立梅 孫紅霞

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，吉林 吉林 132001)

尾加壓素Ⅱ?qū)δI間質(zhì)成纖維細(xì)胞的促增殖作用及其機(jī)制

王 丹 李 紅1白云生1于春艷 陳立梅 孫紅霞

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，吉林 吉林 132001)

目的 探討尾加壓素Ⅱ(UⅡ)對大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞促增殖作用及其機(jī)制。 方法 體外培養(yǎng)大鼠NRK-49F細(xì)胞，采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MT)法、流式細(xì)胞儀(FCM)法分別觀察不同濃度UⅡ作用下，NRK-49F細(xì)胞數(shù)及其細(xì)胞周期的變化。RT-PCR法檢測UⅡ組轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1的表達(dá)。結(jié)果 UⅡ可以促進(jìn)NRK-49F細(xì)胞的增殖活性，隨著UⅡ作用濃度的增加，MTT吸光度值呈先升高后降低的趨勢，其中1×10-9和1×10-8mol/L UⅡ組作用顯著(P<0.01)；在UⅡ的作用下,NRK-49F細(xì)胞 S 期細(xì)胞百分率較對照組明顯增加，而G0～G1期細(xì)胞百分率較對照組明顯降低(P<0.01)；細(xì)胞培養(yǎng)24 h后正常對照組胞質(zhì)中僅見少量TGF-β1的表達(dá)，而經(jīng)UⅡ作用后,TGF-β1的表達(dá)明顯增多。結(jié)論 UⅡ能促進(jìn)大鼠NRK-49F細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞周期，這可能與致纖維化因子TGF-β1的提高有關(guān)，提示UⅡ在腎纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。

尾加壓素Ⅱ；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；增殖；細(xì)胞周期

腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化多發(fā)生于中老年患者，是老年人腎臟的特征性改變。尾加壓素Ⅱ(UⅡ)是一種生長抑素樣環(huán)肽，具有強烈的縮血管效應(yīng)〔1〕，縮血管效應(yīng)是內(nèi)皮素(ET)-1的10倍多〔2〕。近年國內(nèi)外的研究相繼發(fā)現(xiàn)UⅡ并非僅有血流動力學(xué)作用，其在腎臟的高表達(dá)可能有重要的意義〔3〕。但UⅡ?qū)δI間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制尚不清楚。本研究觀察了UⅡ?qū)Υ笫竽I成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響，及其對致纖維化轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1分泌的影響，探討UⅡ在腎間質(zhì)纖維化中可能發(fā)生的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 NRK-49F細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(天津灝洋生物技術(shù)有限公司)，UⅡ(Sigma)，PCR引物，上海生工生物技術(shù)公司。

1.2 大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代 腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞NRK-49F培養(yǎng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞單層貼壁生長，生長至70%～80%匯合時吸棄培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗培養(yǎng)瓶，加入0.25%胰酶消化液，37℃消化。消化后加入培養(yǎng)基，并吹打細(xì)胞，將細(xì)胞懸液，分裝后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖的測定 NRK-49F細(xì)胞增殖應(yīng)用四甲偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測定。將培養(yǎng)的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，加無血清培養(yǎng)液37℃孵育同步化24 h 后,棄上清液,加入含不同濃度UⅡ(1×10-10，1×10-9，1×10-8，1×10-7mol/L)10%小牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，對照組和處理組均重復(fù)3次。于刺激結(jié)束前4 h加入MTT 20 μl/孔(5 g/L)，37℃繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),吸棄上清液,每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),振蕩混勻10 min 后在酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm 波長處測定光吸收值,用只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零。

1.4 細(xì)胞周期測定 常規(guī)消化分組處理，UⅡ組及UⅡ活性阻斷組，收集后用PBS 洗2次,固定于75%預(yù)冷乙醇中,4℃過夜。1 000 r/min離心5 min,吸除乙醇,PBS 洗2次。懸浮于150 μl PBS 中,再加入適量RNase(1 mg/ml),37℃水浴30 min后,除去RNA,加碘化丙啶至50 μl/ml,避光顯色10 min 上機(jī)， 用CEL-LQest 軟件分析細(xì)胞周期。

1.5 RT-PCR法檢測UⅡ抗體對UⅡ誘導(dǎo)NRK-49F細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響 常規(guī)消化分組處理，UⅡ組(10-8mol/L)；UⅡ活性阻斷抗體組：10-5mol/L UⅡ抗體預(yù)處理60 min后，加入10-8mol/L UⅡ培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)細(xì)胞24 h后棄去上清， PBS沖洗，加入TRIzol反復(fù)吹打，移入EP管，提取細(xì)胞總RNA?？俁NA提取后，用紫外分光光度計測260 nm/280 nm的紫外吸收值，重復(fù)測定3次。結(jié)果各組A260/A280在1.8～2.0之間，說明所提取的RNA純度高。RNA溶于無水乙醇，置于-20℃冰箱保存。以mRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物的光密度值與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)mRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物光密度值的比值，作為目的基因mRNA表達(dá)的相對值。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，引物序列用Primer 3軟件設(shè)計。正義：5'-CCAAGGAGACGGAATACAGG-3'，反義：5'-GTGTTGGTTGTAGAGGGCAAG-3'。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 UⅡ誘導(dǎo)NRK-49F細(xì)胞增殖的劑量效應(yīng) NRK-49F細(xì)胞經(jīng)不同濃度UⅡ刺激24 h后，應(yīng)用MTT比色法檢測A490值， NRK-49F細(xì)胞的吸光度值呈濃度依賴性增加趨勢，其中1×10-9mol/L和1×10-8mol/L兩個濃度組(0.610±0.014，0.622±0.085)較對照組(0.529±0.010)明顯升高(P<0.05，P<0.01)。表明在1×10-10～1×10-7mol/L的濃度范圍內(nèi)，UⅡ以濃度依賴方式促進(jìn)NRK-49F細(xì)胞增殖，其中以1×10-8mol/L UⅡ的作用最明顯。另外1×10-10mol/L吸光度值為0.545±0.019，1×10-7mol/L為0.566±0.032。

2.2 UⅡ?qū)RK-49F細(xì)胞周期的影響 UⅡ抗體、尼莫地平同單純用UⅡ組比較，均能降低NRK-49F細(xì)胞S期百分比，其中UⅡ抗體組同UⅡ組比較具有明顯差異(P<0.01)，見表1。

表1 各組NRK-49F細(xì)胞周期比較

與對照組比較：1)P<0.01;與1×10-8mol/L UⅡ組比較：2)P<0.01

2.3 UⅡ抗體、尼莫地平對UⅡ誘導(dǎo)NRK-49F細(xì)胞致纖維化因子TGF-β1表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，對照組NRK-49F細(xì)胞有少量TGF-β1 mRNA(1.091±0.065)表達(dá)，加入UⅡ(1×10-8mol/L)后TGF-β1 mRNA表達(dá)(1.604±0.081)顯著增加(P<0.01)，UⅡ抗體和尼莫地平均能部分降低NRK-49F細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)，但未能完全阻斷，其表達(dá)量仍高于對照組(P<0.05)。其中UⅡ抗體TGF-β1 mRNA表達(dá)(1.202±0.094)，尼莫地平組表達(dá)1.233±0.039，1×10-8mol/L UⅡ組表達(dá)1.272±0.073。見圖1。

1～4:對照組、1×10-8 mol/L UⅡ組、UⅡ抗體組、尼莫地平組

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同通路，是導(dǎo)致慢性腎衰竭的病理學(xué)基礎(chǔ)，其發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展中TGF-β是研究得較為透徹的致病因子之一。作為一種強效的致纖維化因子，TGF-β過度生成或活性升高與多種原因引起的腎纖維化密切相關(guān)，是腎臟纖維化過程中的最終調(diào)節(jié)因子。

UⅡ不僅具有縮血管效應(yīng)，還是體內(nèi)重要的促有絲分裂原，能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖〔4〕，研究發(fā)現(xiàn)，UⅡ?qū)θ槭竽I小球系膜細(xì)胞具有誘導(dǎo)作用〔5〕，提示了UⅡ可能參與糖尿病腎病系膜細(xì)胞的增殖發(fā)病學(xué)。UⅡ及其受體在腎臟有豐富表達(dá)〔6〕。在健康人腎臟UⅡ主要存在于腎小管和集合管上皮細(xì)胞，尤其是遠(yuǎn)曲小管。這些可能意味著UⅡ在腎臟功能調(diào)節(jié)中有著重要的作用。

近年研究顯示〔7〕，UⅡ能協(xié)同異丙腎上腺素所致心肌肥大和心肌纖維化過程，促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，這與本文研究UⅡ在腎間質(zhì)纖維化中的作用較為相似。本研究結(jié)果表明，UⅡ促進(jìn)TGF-β1致纖維化因子的表達(dá)，而且此作用可被UⅡ抗體及鈣通道阻斷劑所抑制。UⅡ與其受體結(jié)合，從而產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，如刺激產(chǎn)生和分泌TGF-β，促進(jìn)細(xì)胞增殖，增加ECM合成和分泌，從而加速腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，加重腎功能損害，即UⅡ通過腎臟細(xì)胞的自分泌或旁分泌作用參與纖維化病理過程，在腎間質(zhì)纖維化病變的發(fā)生機(jī)制中，UⅡ可能是一個引起腎小管損傷和纖維化形成的新的重要致病因子。UⅡ具有促TGF-β生成作用，但UⅡ與TGF-β的具體分子關(guān)系如何，UⅡ是否是腎間質(zhì)纖維化的始動因素之一，還是二者協(xié)同起作用，這是值得進(jìn)一步深入研究的課題。

UⅡ功能抑制劑或受體拮抗劑可能會有助于闡明UⅡ在腎臟疾病中的生物學(xué)作用。Palosuran是一個有效的人UⅡ特異性拮抗劑〔8〕，可以呈濃度依賴性抑制UⅡ誘導(dǎo)的大鼠大動脈環(huán)的收縮，能競爭性作用于UⅡ。最近報道，Palosuran能延緩腎臟損傷的進(jìn)展。然而，在終末期腎衰透析患者，UⅡ發(fā)揮心肌保護(hù)作用〔9〕，血清UⅡ濃度高的患者發(fā)生心血管意外的危險性低，推測是由UⅡ影響了交感神經(jīng)活性以及一氧化氮系統(tǒng)而引起的。因此，UⅡ受體選擇性拮抗劑是否能廣泛應(yīng)用于臨床，其適應(yīng)證、具體用藥時間等，還需要做進(jìn)一步探討。

1 Ames RS,Sarau HM,Chambers JK,etal.Human urotensin Ⅱ is a potent vasocontrictor and agonist for the orphan receptor GPR14〔J〕.Nature,1999;401(6750):282-6.

2 Langham RG,Kelly DJ,Gow RM,etal.Increased expression of urotensin Ⅱand urotensin Ⅱreceptor in human diabetic nephropathy〔J〕.Am J Kidney Dis,2004;44(5):826-31.

3 張勇剛，陳亞紅，馬春艷，等.尾加壓素Ⅱ的促絲裂作用〔J〕.中國動脈硬化雜志，2001;9(1)：14-6.

4 Takahashi K,Totsune K,Murakami O,etal.Expression of urotensin Ⅱ and its receptor in adrenal tumors and stimulation of proliferation of cultured tumor cells by urotensinⅡ〔J〕.Peptides,2003;24(2):301-6.

5 張勇剛，魏睿宏，李玉光，等.尾加壓素Ⅱ促進(jìn)腎系膜細(xì)胞增殖的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制研究〔J〕.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007;20(3):132-4.

6 Tzanidis A,Hannan RD,Thomas WG,etal.Direct action of urotensinⅡ on the heart:implications for cardic fibrosis and hypertrophy 〔J〕.Circ Res,2003;93(3):246-53.

7 Zhang G,Kernan KA,Thomas A,etal.A novel signaling pathway:fibroblast nicotinic receptor alpha1 binds urokinase and promotes renal fibrosis〔J〕.J Biol Chem,2009;284(42):29050-64.

8 Watson AM,Olukman M,Koulis C,etal.Urotensin Ⅱ receptor antagonism confers vasoprotective effects in diabetes associated atherosclerosis:studies in humans and in a mouse model of diabetes.〔J〕.J Diabetologia,2013;56(5):1155-65.

9 You Z,Al Kindi H,Abdul-Karim A,etal.Blocking the urotensin Ⅱ receptor pathway ameliorates the metabolic syndrome and improves cardiac function in obese mice 〔J〕.FASEB J,2014;28(3):1210-20.

〔2014-10-25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究資助項目 (2012144)

王 丹(1975-),女，副教授，博士，主要從事腎臟病理學(xué)研究。

R692.32

A

1005-9202(2015)12-3261-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.033

1 吉化總醫(yī)院急診科