李樹立 郝秋娟 趙士豪 張瑞平

(河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050061)

白果總黃酮超聲波提取及抗衰老作用

李樹立 郝秋娟 趙士豪 張瑞平

(河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050061)

目的 探討確立白果總黃酮最佳提取方法并研究其抗衰老活性。方法 選取4個(gè)品種的白果：佛手、佛指、金墜、圓鈴，采用正交法確立總黃酮最佳超聲波提取工藝，并通過蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測定提取物中的總黃酮含量；采用光度計(jì)比色法測定4個(gè)品種白果總黃酮提取物的清除二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基，清除超氧陰離子自由基，清除2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基的能力以及還原能力。結(jié)果 白果總黃酮超聲波提取最佳工藝為：時(shí)間50 min、溫度80℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶15；4種白果總黃酮含量均較高，其中由高到低依次為：佛指>金墜>佛手>圓鈴。抗衰老作用研究顯示，佛指清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基、ABTS自由基和還原能力最強(qiáng)，其次為圓鈴，兩者均優(yōu)于佛手、金墜；且4種白果總黃酮均在質(zhì)量濃度400 μg/ml時(shí)達(dá)到較高水平，之后進(jìn)入平臺期。結(jié)論 白果總黃酮具有較好的抗衰老作用，其中以佛指總黃酮效果最佳。

白果；總黃酮；抗衰老；抗氧化

白果為銀杏的種仁，含有蛋白質(zhì)、糖類、胡蘿卜素、礦物元素、銀杏酸、黃酮等成分。其中黃酮類化合物為白果重要的功能成分，具有抗炎、抗感染、抗衰老等生物活性〔1〕。自由基為機(jī)體氧化反應(yīng)生成的有害物質(zhì)，有強(qiáng)氧化性，能夠通過損傷機(jī)體組織和細(xì)胞，引起人體的慢性疾病和衰老效應(yīng)。采用黃酮類化合物來清除人體內(nèi)的自由基，進(jìn)而對抗衰老是近年來研究熱點(diǎn)之一。目前，國內(nèi)外對銀杏黃酮抗氧化和衰老的研究較多，但對白果黃酮類化合物相關(guān)研究較少〔2〕。本次研究對白果總黃酮的提取方法和不同品種白果總黃酮的抗衰老作用進(jìn)行初步研究，旨在為白果作為天然抗氧化及衰老功能性食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑 4個(gè)品種的白果：佛手、佛指、金墜、圓鈴，均購于石家莊市天客隆農(nóng)貿(mào)市場；無水乙醇、氫氧化鈉、三氯乙酸等試劑均為分析純，購于天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購于中國藥品生物制品檢定所，批號0080-9705；二苯基苦基苯肼(DPPH)、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)購于美國Sigma公司。

1.2 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮RE52-99型)；電子分析天平(瑞士梅特勒AL204-IC 型)；水循環(huán)真空泵(上海亞榮X-5型)；紫外可見分光光度儀(島津UV-2550)；超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司 JY98-3D型)；中藥粉碎機(jī)(濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司)；鼓風(fēng)干燥箱(丹東瓦德科技有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京長安科學(xué)儀器廠)。

1.3 白果總黃酮提取與測定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用紫外分光光度法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，首先取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑干燥至恒重，用30%乙醇配成不同濃度的蘆丁溶液，加入0.5 mol/L的NaNO2溶液1.0 ml搖勻，放置10 min，加入1.0 mol/L的Al(NO3)3溶液1.0 ml搖勻，放置10 min，再加入0.4 mol/L的NaOH溶液10.0 ml，加水定容至刻度，搖勻，10 min后以空白試劑為參比，測定510 nm波長處的吸光度，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 白果總黃酮提取 將4個(gè)品種的白果剝皮，取果肉至于80℃烘箱中48 h后粉碎，過40目篩。取20 g放入500 ml的三角瓶中，加入80%的乙醇溶液300 ml，80℃下超聲提取50 min，連續(xù)提取濾渣2次，最后將收集到的提取液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后用80%的乙醇溶液定容至100 ml，使用紫外可見分光光度儀在510 nm處測定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量，所有樣本均測試3次。

1.3.3 白果總黃酮正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，實(shí)驗(yàn)因素包括提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積、料液比，選用L9(34)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 白果總黃酮提取正交實(shí)驗(yàn)因素水平

1.4 白果總黃酮抗衰老測定測定

1.4.1 清除DPPH自由基測定 配制不同質(zhì)量濃度的白果總黃酮提取液，分別取4 ml加入4 ml的DPPH溶液(0.1 mmol/L，溶劑為無水乙醇)，混勻，置于黑暗環(huán)境中反應(yīng)40 min，在517 nm處測定吸光度，樣品均測定3次。DPPH清除率(%)=〔1-(A-A0)/A1)〕×100%。其中A為樣品與DPPH溶液混合后的吸光度；A0為樣品本身的吸光度；A1為DPPH溶液吸光度。

1.4.2 清除超氧陰離子自由基測定 采用鄰苯三酚自氧化法測定：向比色管中加入1 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.5)5 ml，26℃條件下水浴30 min，分別加入0.5 ml不同濃度的4種白果總黃酮提取液及3.0 mmol/L的鄰苯三酚0.9 ml，混勻，26℃水浴反應(yīng)5 min，立即加入3滴10 mmol/L的HCl終止反應(yīng)，在310 nm處測定吸光度。超氧陰離子清除率(%)=〔1-(A1-A2)/A0〕×100%。其中A1為只加鄰苯三酚的吸光度；A2為樣品與鄰苯三酚的吸光度；A0為只加樣品的吸光度。

1.4.3 清除ABTS自由基測定 將8 mmol/L的ABTS溶液20 ml和280 mmol/L的高錳酸鉀溶液0.4 ml混勻，黑暗環(huán)境中靜置16 h，制得ABTS自由基溶液，配置成不同質(zhì)量濃度的備用液。分別將四種白果總黃酮提取液2 ml、ABTS自由基溶液4 ml、蒸餾水2 ml依次加入試管中，在黑暗環(huán)境中反應(yīng)40 min，之后在740 nm處測定吸光度，樣品均測定3次。ABTS清除率(%)=〔1-(A-A0)/A1〕×100%。其中A為樣品與ABTS溶液混合后的吸光度；A0為樣品本身的吸光度；A1為ABTS溶液吸光度。

1.4.4 還原能力測定 采用普魯士法測定：將2 ml不同濃度的總黃酮提取液與5.0 ml的0.3 mmol/L磷酸緩沖液、5.0 ml的1%鐵氰化鉀混勻，40℃條件下水浴30 min，再加入10%三氯乙酸5.0 ml，混勻后在4 000 r/min條件下離心20 min，取上清液10 ml與同體積的蒸餾水混合，再加入0.1%三氯化鐵2 ml，在740 nm處測定吸光度，測量值越高說明還原能力越強(qiáng)。

2 結(jié) 果

2.1 白果總黃酮含量 以蘆丁質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程A=2.176 0C+0.010 5，R2=0.999 5。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，采用外標(biāo)法測得佛手、佛指、金墜、圓鈴樣品總黃酮含量依次為0.089%、0.174%、0.136%、0.081%。其中佛指總黃酮含量最高，圓鈴最低。

2.2 白果總黃酮提取正交實(shí)驗(yàn) 四個(gè)因素中對黃酮提取的影響程度為C>A>B>D。可初步確定白果總黃酮提取的最佳工藝條件為A3B2C3D2，即提取時(shí)間50 min、提取溫度80℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶15。見表2。

2.3 白果總黃酮對DPPH自由基的清除 四種白果總黃酮質(zhì)量濃度在50～350 μg/ml范圍內(nèi)，對DPPH自由基清除率隨濃度增加而顯著增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度超過350 μg/ml時(shí)，清除率趨于平穩(wěn)。四種白果總黃酮對DPPH自由基的清除能力：佛指>圓鈴>金墜>佛手。見圖1。

2.4 白果總黃酮對超氧陰離子自由基的清除 佛指總黃酮質(zhì)量濃度在50～300 μg/ml范圍內(nèi)，對超氧陰離子自由基清除率隨濃度增加而顯著增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度超過300 μg/ml時(shí)，清除率趨于平穩(wěn)。金墜、佛手、圓鈴總黃酮質(zhì)量濃度在50～450 μg/ml范圍內(nèi)，對超氧陰離子自由基清除率隨濃度增加而顯著增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度超過450 μg/ml時(shí)，清除率趨于平穩(wěn)。佛總黃酮指對超氧陰離子自由基的清除能力優(yōu)于金墜、佛手、圓鈴。見圖2。

表2 白果總黃酮提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 4種白果總黃酮對DPPH自由基的清除作用

圖2 4種白果總黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用

2.5 白果總黃酮對ABTS的清除 4種白果總黃酮質(zhì)量濃度在50～400 μg/ml范圍內(nèi)，對ABTS的清除率隨濃度增加而顯著增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度超過400 μg/ml時(shí)，清除率趨于平穩(wěn)。當(dāng)濃度在50～200 μg/ml范圍內(nèi)時(shí)4種白果總黃酮對ABTS的清除率相似；>200 μg/ml時(shí)，佛指和圓鈴對ABTS的清除率較強(qiáng)。見圖3。

圖3 4種白果總黃酮對ABTS的清除作用

2.6 白果總黃酮的還原力 4種白果總黃酮質(zhì)量濃度在50～400 μg/ml范圍內(nèi)，還原力隨濃度增加而顯著增強(qiáng)，且佛指的還原力最強(qiáng)；>400 μg/ml后，4種白果總黃酮的還原力逐漸平穩(wěn)，且無明顯差異。見圖4。

圖4 四種白果總黃酮的還原力

3 討 論

人體細(xì)胞的氧化還原代謝過程中，部分氧原子未能得到充分的電子而無法與氫原子完全結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生了氧自由基，過剩的氧自由基會作用于組織、細(xì)胞等脂類物質(zhì)，導(dǎo)致其生成脂質(zhì)過氧化物，沉積于細(xì)胞膜上導(dǎo)致細(xì)胞活性降低，機(jī)體組織器官功能衰退，進(jìn)入衰老狀態(tài)，因此抗氧自由基在對抗衰老中具有重要意義〔3〕。目前研究認(rèn)為，導(dǎo)致人體衰老的主要自由基包括DPPH自由基、超氧陰離子自由基、ABTS自由基〔4〕。本研究提示今后對白果總黃酮研究中應(yīng)首選佛指總黃酮，并可對質(zhì)量濃度為400 μg/ml的白果總黃酮進(jìn)行相關(guān)抗衰老動物或細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討其抗衰老活性。

1 才 真.天然藥物抗氧化、抗衰老的研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2014；20(16)：2994-5.

2 李素云，王立芹，鄭稼琳，等.自由基與衰老的研究進(jìn)展〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2007；27(20)：2046-8.

3 趙燕燕，劉新霞，陳春生，等.機(jī)體衰老時(shí)體內(nèi)指標(biāo)變化〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2010；30(19)：2855-7.

4 張 岳，余 瑾，張 藝，等.衰老可導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞氧化損傷修復(fù)能力降低〔J〕.中國組織工程研究，2013；17(10)：1801-8.

〔2014-10-19修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.10237101D-9)

李樹立(1963-)，女，碩士，副教授，主要從事生物工程、生物活性物質(zhì)提取研究。

R28

A

1005-9202(2015)12-3252-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.029