李延玲 張懷宏

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院感染肝病科，河南 南陽(yáng) 473000)

苦參堿及其衍生物抗肝纖維化效應(yīng)

李延玲 張懷宏

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院感染肝病科，河南 南陽(yáng) 473000)

目的 探討苦參堿及其衍生物抗肝纖維化效應(yīng)及其抑制慢性炎癥狀況下單核細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)作用。方法 24只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、造模組、苦參堿組以及衍生物組，每組6只。造模組、苦參堿組以及衍生物組進(jìn)行肝纖維化造模。同時(shí)，苦參堿組予苦參堿30 mg/kg灌胃，衍生物組予衍生物30 mg/kg灌胃，造模組和正常對(duì)照組PBS 液0.5 ml灌胃，1次/d，每周連續(xù)5 d。6 w末檢測(cè)肝臟組織羥脯氨酸水平、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1 mRNA水平，單核細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果 造模組羥脯氨酸水平、MCP-1 mRNA表達(dá)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)及百分比顯著高于正常對(duì)照組，苦參堿組和衍生物組顯著低于造模組，而衍生物組顯著低于苦參堿組(P<0.01或<0.05)。結(jié)論 苦參堿及其衍生物衍生物能夠抑制肝臟纖維化，減少單核細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)，降低MCP-1 mRNA的表達(dá)，并且其衍生物的作用較苦參堿更明顯。

苦參堿；單核細(xì)胞；肝臟浸潤(rùn)；肝纖維化

肝纖維化是多種原因?qū)е碌母渭?xì)胞壞死、炎癥刺激導(dǎo)致肝臟內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，并沉積在肝細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程；是大多數(shù)慢性肝病的共有特征，是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的中間環(huán)節(jié)。因此，能夠有效阻斷肝纖維化發(fā)生、發(fā)展，對(duì)預(yù)防肝硬化、改善慢性肝病患者的預(yù)后具有有重要的意義〔1〕。炎癥反應(yīng)伴隨慢性肝病發(fā)展為肝纖維化過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，肝固有細(xì)胞的活化伴隨單核淋巴細(xì)胞從血液循環(huán)中向肝損傷部位浸潤(rùn)。苦參堿是豆科槐屬植物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用。研究顯示其還具有一定的抗肝臟纖維化的作用〔2,3〕。本研究探討苦參堿及其衍生物抗肝纖維化效應(yīng)及其抑制慢性炎癥狀況下單核細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6 小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SPF級(jí)，品系代碼：213)，雌性，周齡5～8 w，室溫飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 主要試劑和儀器 苦參堿(上海同田生物技術(shù)股份有限公司，10 mg/支，編號(hào)：E-0064)，其衍生物，本實(shí)驗(yàn)室制備，小鼠單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1抗體、Ⅳ型膠原酶、總RNA提取試劑(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)。Elispot 96孔板，6、24、96孔板(賽默飛世爾科技公司)。高速冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：H1650R)，CO2孵箱(上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司，型號(hào)：2406-2)，電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上虞市華宏凈化設(shè)備廠，型號(hào)：XFH-75MA)。

1.3 主要試劑配制 凍存培養(yǎng)液：無(wú)菌培養(yǎng)液9 ml+無(wú)菌甘油或二甲基亞砜1 ml，混勻，4℃保存，備用。BS緩沖液:NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H20 3.48 g，KH2PO40.2 g，三蒸水溶解至1 000 ml，分裝后滅菌。細(xì)胞裂解液：NH4Cl，0.15 mol/L，KHCO31.0 mmol/L，Na2EDTA 0.1 mmol/L，pH7.4，滅菌，分裝，備用。完全培養(yǎng)基：5 000 ml Milli-Q水+培養(yǎng)基干粉5包，溶解后加NaHCO310 g，pH7.1，過(guò)濾后分裝，4℃保存。10%胎牛血清培養(yǎng)液：胎牛血清50 ml+無(wú)菌培養(yǎng)液+1%青霉素和鏈霉素。

1.4 造模、分組、給藥方法 24只小鼠，隨機(jī)分成正常對(duì)照組、造模組、苦參堿組以及衍生物組，每組6只。造模組、苦參堿組以及衍生物組給予6%的CCl4溶液(CCl4+玉米胚芽油)0.2 ml腹腔注射，每周2次，共12次。對(duì)照組注射0.2 ml玉米胚芽油。從第1周開(kāi)始，苦參堿組予苦參堿30 mg/kg配制成0.5 ml溶液灌胃，衍生物組予衍生物30 mg/kg配制成0.5 ml溶液灌胃，1次/d，每周連續(xù)5 d。造模組和正常對(duì)照組予PBS液0.5 ml灌胃。6 w末摘取肝臟，甲醛溶液固定，行組織病理檢測(cè)。檢測(cè)羥脯氨酸水平、肝組織MCP-1 mRNA水平，分析肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，檢測(cè)單核細(xì)胞得數(shù)目。

1.5 肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞分離 小鼠麻醉，開(kāi)腹暴露肝臟，D-Hanks灌注，注入1%Ⅳ型膠原酶消化，取出肝臟，DMEM培養(yǎng)基洗滌，加入10 ml DMEM培養(yǎng)中，撕碎肝臟，吸取干組織混血液70 μm篩網(wǎng)濾過(guò)，離心，DMEM培養(yǎng)基沖洗，離心。DMEM培養(yǎng)基重20 ml重懸，離心，獲得非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。采用含有FBS(10%)和青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 μg/ml)的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)調(diào)整到適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度。取5×105個(gè)分離的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式細(xì)胞，分析單核細(xì)胞占肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的百分比。

1.6 肝組織MCP-1 mRNA水平檢測(cè) 取凍存肝組織，提取肝細(xì)胞總RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，檢測(cè)肝組織MCP-1 mRNA水平。

1.7 羥脯氨酸水平檢測(cè) 取濕重0.08～0.1 g的肝組織，加1 ml水溶液，沸水水浴水解20 min，pH值調(diào)節(jié)到6.0～6.8，采用堿水解法檢測(cè)羥脯氨酸水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行F或t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組羥脯氨酸水平比較 造模組羥脯氨酸〔(174.8±10.5)μg/g〕顯著高于對(duì)照組〔(61.2±5.3)μg/g〕，苦參堿組〔(125.7±7.4)μg/g〕和衍生物組〔(113.3±5.9)μg/g〕顯著低于造模組，而衍生物組顯著低于苦參堿組(P<0.01或<0.05)。

2.2 干預(yù)后各組肝組織單核細(xì)胞計(jì)數(shù)及百分比 造模組Grlhigh單核細(xì)胞和Grllow單核細(xì)胞計(jì)數(shù)以及百分比較對(duì)照組均顯著升高(P<0.01)，但Grlhigh單核細(xì)胞升高更明顯(P<0.01)，苦參堿組和衍生物組Grlhigh單核細(xì)胞和Grllow單核細(xì)胞較造模組均顯著下降(P<0.01)，衍生物組下降更明顯(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 干預(yù)后各組肝組織單核細(xì)胞計(jì)數(shù)及百分比±s)

與對(duì)照組比較：1)P<0.01，與造模組比較：2)P<0.01，與苦參堿組比較：3)P<0.05,與Grlhigh單核細(xì)胞比較：4)P<0.01

2.3 各組肝組織MCP-1 mRNA表達(dá) 與對(duì)照組(1.0±0.2)比較，造模組MCP-1 mRNA(5.0±0.8)顯著升高，苦參堿組(2.2±0.5)和衍生物組(1.7±0.2)顯著低于造模組，衍生物組又顯著低于苦參堿組(P<0.01或<0.05)。

3 討 論

研究顯示肝纖維化是肝臟對(duì)慢性炎癥損傷后進(jìn)行的主動(dòng)修復(fù)反應(yīng)，主要特征為肝臟細(xì)胞外基質(zhì)增生、沉積，肝小葉纖維化以及肝竇毛細(xì)血管化，從而導(dǎo)致肝功能減退以及門(mén)靜脈高壓。多種致病因子損傷肝細(xì)胞，使其產(chǎn)生、釋放大量的氧自由基、蛋白酶、脂質(zhì)過(guò)氧化物、細(xì)胞因子以及生長(zhǎng)因子等，肝臟炎癥反復(fù)發(fā)作并持續(xù)存在，導(dǎo)致肝臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞)以及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種的細(xì)胞因子，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-D、血小板衍生生長(zhǎng)因、腫瘤壞死因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮素-1等，激活肝星狀細(xì)胞，并導(dǎo)致其增殖，轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞〔4～6〕。一方面肌成纖維樣細(xì)胞接受旁分泌的刺激信號(hào)，進(jìn)行自身增殖，另一方面其本身分泌纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，進(jìn)一步自身激活，維持及激活狀態(tài)，并定向遷移、聚集到肝臟損傷部位，合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原、硫酸軟骨素、蛋白多糖、透明質(zhì)酸、硫酸皮膚素等。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-D能夠下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)以及活性，增強(qiáng)組織金屬蛋白酶抑制劑的表達(dá)以及活性，從而使細(xì)胞外基質(zhì)的生成和降解平衡被打破，導(dǎo)致大量細(xì)胞外基質(zhì)在肝組織內(nèi)沉積，最終發(fā)生肝臟纖維化〔7〕。Kupffer細(xì)胞以及肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化是發(fā)生肝臟纖維化細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

目前對(duì)肝纖維化發(fā)生機(jī)制的研究以及預(yù)防藥物的開(kāi)發(fā)主要關(guān)注肝臟固有細(xì)胞，尤其是Kupffer細(xì)胞以及HSC。肝臟組織內(nèi)的Kupffer細(xì)胞激活后分泌大量細(xì)胞因子，這在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。肝臟損傷后，首先激活Kupffer細(xì)胞，釋放細(xì)胞因子，活化肝HSC，啟動(dòng)肝纖維化進(jìn)程。炎癥反應(yīng)、慢性肝損傷主動(dòng)性修復(fù)過(guò)程發(fā)展為肝臟纖維化的伴隨過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，肝臟固有細(xì)胞活化伴隨著單核淋巴細(xì)胞從血液循環(huán)向肝臟損傷部位浸潤(rùn)。肝組織損傷后，產(chǎn)生趨化信號(hào)，從而招募淋巴細(xì)胞至肝臟，發(fā)揮中和感染、清除損傷細(xì)胞、中和自身抗原等功能。大多情況下，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷加劇，炎癥細(xì)胞分泌可溶性因子以及氧化應(yīng)激促使纖維化的發(fā)生。因此，細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)在肝纖維化過(guò)程中的作用越來(lái)越被關(guān)注。核細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)參與了慢性肝病、肝纖維化的過(guò)程，并發(fā)揮重要的作用。Kupffer細(xì)胞早已被確立是源自髓系的單核細(xì)胞。在靜息狀下血液循環(huán)中單核細(xì)胞也會(huì)不斷對(duì)肝臟內(nèi)的Kupffer細(xì)胞進(jìn)行更新，而發(fā)生炎癥時(shí)，血液循環(huán)中的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)肝臟，這些外源炎性單核細(xì)胞和激活Kupffer細(xì)胞在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮了重要的作用。人類(lèi)的單核細(xì)胞主要有兩個(gè)亞群，包括CD14highCD16-單核巨噬細(xì)胞，表達(dá)CCR2，即C-C類(lèi)趨化因子受體，MCP-1是其特異性配體，另一組為CD141owCD16+單核細(xì)胞,其不表達(dá)CCR2〔8,9〕。CD11b+F4/80+Grlhigh單核細(xì)胞是浸潤(rùn)于炎癥部位的巨噬細(xì)胞以及樹(shù)突細(xì)胞的前體細(xì)胞， Grllow單核細(xì)胞是組織駐留的正常狀態(tài)下靜息巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞，在肝臟主要是Kupffer細(xì)胞的前體。Grlhigh在炎癥情況下受相關(guān)趨化因子以及Grllow單核細(xì)胞在不同情況下(炎癥和非炎癥)進(jìn)入組織受組織分泌的不同趨化分子控制。肝臟炎癥時(shí)，Grlhigh單核細(xì)胞在趨化因子MCP-1的作用進(jìn)入肝臟〔10〕。肝硬化患者的肝臟組織中發(fā)現(xiàn)CCR2配體MCP-1高表達(dá)。本研究提示在肝纖維化過(guò)程中，Grlhigh單核細(xì)胞可能發(fā)揮了更重要的作用。

苦參堿是豆科槐屬植物，生物堿類(lèi)是苦參堿的有效成分，具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤等用。目前臨床上使用苦參堿制劑治療急慢性肝炎取得了較好的效果?？鄥A的穩(wěn)定肝細(xì)胞膜、免疫調(diào)節(jié)作用以及抗病毒的作用，可能是治療急慢性肝炎的藥理機(jī)制〔11,12〕?？鄥A具有改善慢性乙肝患者肝纖維化的過(guò)程，顯著降低患者血清肝纖維化相關(guān)指標(biāo)?？鄥A能夠降低CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、膽汁酸、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ型膠原以及肝臟指數(shù)，使肝組織中羥脯氨酸含量下降。本研究提示苦參堿具有抑制單核-巨噬細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，抑制肝細(xì)胞的活化以及增殖的作用?？鄥A的衍生物對(duì)抑制肝纖維化、降低單核細(xì)胞浸潤(rùn)、降低MCP-1的表達(dá)等作用均優(yōu)于苦參堿。這說(shuō)明苦參堿衍生物具有更強(qiáng)的抑制肝臟炎癥以及肝纖維化的作用。

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〔2013-11-22修回〕

(編輯 苑云杰)

河南省科技廳課題(No.122300410223)

張懷宏(1958-)，女，主任醫(yī)師，主要從事肝病和感染性疾病研究。

李延玲(1973-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事肝病和感染性疾病研究。

R28

A

1005-9202(2015)12-3248-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.027