秦 偉 金 寰 羅孝美 陳遠(yuǎn)壽

(遵義醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563000)

硫化氫減輕嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的機(jī)制

秦 偉 金 寰 羅孝美 陳遠(yuǎn)壽

(遵義醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563000)

目的 觀察硫化氫(H2S)對(duì)嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀、體質(zhì)量、一氧化氮(NO)含量以及一氧化氮合酶(NOS)活性的影響，探討H2S減輕嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的機(jī)制。方法 將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、嗎啡依賴組、硫氫化鈉(NaHS)組和羥胺(HA)組。嗎啡依賴組按劑量遞增原則皮下注射嗎啡，NaHS組和HA組分別于注射嗎啡前30 min腹腔注射NaHS和HA，對(duì)照組注射等量生理鹽水。納洛酮誘發(fā)戒斷癥狀確定模型成功建立，然后觀察四組大鼠戒斷癥狀和體質(zhì)量變化，比色法測(cè)定大鼠血漿及海馬組織NO含量，Real time PCR測(cè)定海馬組織nNOS mRNA表達(dá)量。結(jié)果 嗎啡依賴組和HA組與對(duì)照組比較，戒斷癥狀積分升高(P<0.05)，體質(zhì)量下降(P<0.05)，血漿和海馬組織NO含量以及NOS活性升高(P<0.05)；NaHS組與依賴組相比，戒斷癥狀積分降低(P<0.05)，體質(zhì)量增加(P<0.05)，NO含量以及NOS活性下降(P<0.05)而NaHS組與對(duì)照組比較，戒斷癥狀、體質(zhì)量、NO含量以及NOS活性均無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 外源性H2S可減輕嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀，控制嗎啡依賴大鼠體質(zhì)量的下降，其作用機(jī)制可能與外源性H2S抑制NO的產(chǎn)生、下調(diào)nNOS mRNA表達(dá)有關(guān)。

硫化氫；嗎啡依賴；戒斷癥狀；體質(zhì)量；一氧化氮/一氧化氮合酶

長(zhǎng)期應(yīng)用阿片類藥物會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生軀體性和精神性依賴，一旦突然停藥，機(jī)體將產(chǎn)生流汗、顫抖、發(fā)熱、血壓升高、肌肉疼痛和痙攣等一系列生理功能紊亂，即戒斷綜合征〔1〕。目前臨床上主要采用脫毒治療，但是其復(fù)吸率卻高達(dá)95%。因此，研究藥物依賴的發(fā)生機(jī)制和尋找治療藥物依賴的新途徑有著重要的理論意義和社會(huì)意義。目前研究認(rèn)為，H2S在神經(jīng)、心血管以及免疫系統(tǒng)等方面均發(fā)揮著重要作用，尤其是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中能有效減緩缺血性腦梗死、阿爾茨海默病、熱驚厥、帕金森病的發(fā)生發(fā)展〔2，3〕。近年有研究報(bào)道，外源性硫氫化鈉(NaHS)可減輕海洛因成癮大鼠戒斷癥狀，提高大鼠伏隔核H2S水平，而海洛因會(huì)降低大鼠伏隔核H2S水平〔4〕，課題組最近的研究也觀察到外源性H2S可減輕大鼠學(xué)習(xí)記憶減退及神經(jīng)元損傷，提示H2S具有抗阿片類物質(zhì)依賴作用，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。阿片類物質(zhì)依賴的機(jī)制十分復(fù)雜，可能涉及體內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)，如去甲腎上腺素、多巴胺、一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)等多種因素。因此，該研究通過(guò)建立嗎啡依賴大鼠模型，采用比色分析法和Real time PCR技術(shù)，結(jié)合嗎啡依賴大鼠戒斷實(shí)驗(yàn)，觀察H2S對(duì)嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的影響以及NO/NOS變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠(由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)40只，體重為180～220 g。隨機(jī)分為對(duì)照組(生理鹽水)、依賴組(嗎啡依賴大鼠)、NaHS組(嗎啡依賴大鼠+NaHS)、羥胺(HA)組(嗎啡依賴大鼠+HA)，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 鹽酸嗎啡(沈陽(yáng)第一制藥廠)；鹽酸納洛酮注射液(益僑湖南制藥有限公司)；NaHS與HA(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)；NO測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；nNOS mRNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(日本TaKaRa生物工程公司)。根據(jù)GenBank查出nNOS和β-actin的引物序列，nNOS上游5′CCTATGCCAAGACCCTGTGTGA3′，下游3′CATTGCCAAAGGTGCTGGTG5′，產(chǎn)物長(zhǎng)度132 bp；β-actin上游5′GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA3′，下游3′GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG5′，產(chǎn)物長(zhǎng)度150 bp。

1.3 儀器設(shè)備 Eppendof Mastercycler Gradient PCR儀由德國(guó)Eppendorf 公司生產(chǎn)，Icycler 熒光定量PCR儀由美國(guó)BIO-RAD 公司生產(chǎn)，Tu-1810 紫外分光光度計(jì)由北京通用分析儀器公司生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 建模 按逐日遞增的原則，采用皮下注射鹽酸嗎啡復(fù)制嗎啡依賴大鼠模型，以同樣方法給予等量生理鹽水建立對(duì)照組模型，第10天給予5 mg/kg納洛酮皮下注射誘發(fā)戒斷癥狀，參照柳田知司標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行戒斷評(píng)分〔5〕，確定嗎啡依賴大鼠模型是否成功建立。第10～12天，每天按50 mg/kg注射一次嗎啡維持依賴大鼠模型。NaHS組和HA組分別于注射嗎啡前30 min給予腹腔注射NaHS(14 μmol/kg)和HA(12.5 mg/kg)。

1.4.2 戒斷癥狀及體重觀察 各組大鼠分別于戒斷前和戒斷后60 min稱重，并計(jì)算體重變化值。戒斷癥狀的觀察參照柳田知司評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分別記錄可數(shù)和不可數(shù)癥狀，可數(shù)癥狀包括大鼠齒顫、扭體﹑站立﹑濕狗樣抖﹑伸展﹑清理皮毛等，分別記錄各自出現(xiàn)的次數(shù)不可數(shù)癥狀為上瞼下垂，每2分鐘評(píng)定一次。以上癥狀觀察30 min，全部癥狀得分之和為戒斷評(píng)分。

1.4.3 NO含量測(cè)定 各組大鼠戒斷癥狀評(píng)分結(jié)束后，35%水合氯醛(1 ml/kg)麻醉，斷頭取血，剝離出完整海馬凍存。血漿NO的測(cè)定采用硝酸還原酶法。海馬NO的測(cè)定，首先將凍存海馬組織取出后勻漿，低溫低速離心10 min(3 000 r/min)，取離心好的勻漿上清液分別測(cè)定總蛋白含量和NO含量，參照考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒和NO測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.4 nNOS mRNA表達(dá)的檢測(cè) 取出凍存液中的海馬組織，采用Real-time PCR方法提取組織中總RNA，并檢測(cè)RNA的純度和濃度。實(shí)驗(yàn)中RNA純化、純度和含量測(cè)定、逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。目的基因的相對(duì)定量方法采取以PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)(Ct值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析，運(yùn)用S-N-K法進(jìn)行組間比較。

2 結(jié) 果

2.1 H2S對(duì)嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀及體重的影響 納洛酮誘發(fā)戒斷癥狀發(fā)現(xiàn)，嗎啡依賴組、HA組大鼠均出現(xiàn)濕狗樣抖、伸展、扭體、理毛、齒顫以及直立等癥狀，戒斷癥狀分值明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，表明成功建立嗎啡依賴大鼠模型。而NaHS組的戒斷癥狀分值低于嗎啡依賴組(P<0.05)，NaHS組與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。納洛酮催促后60 min，嗎啡依賴組和HA組體重變化明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，NaHS組的體重變化低于嗎啡依賴組(P<0.05)，NaHS組與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 H2S對(duì)嗎啡依賴大鼠血漿及海馬組織NO含量的影響 與對(duì)照組比較，嗎啡依賴組、HA組大鼠血漿和海馬組織NO含量顯著增高(P<0.05)，而NaHS組大鼠血漿和海馬組織NO含量低于嗎啡依賴組(P<0.05)，NaHS組與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 H2S對(duì)嗎啡依賴大鼠海馬組織nNOS mRNA表達(dá)的影響 嗎啡依賴組、HA組大鼠海馬組織的nNOS mRNA表達(dá)嗎啡(1.82±0.34、1.88±0.45)較對(duì)照組增加(0.88±0.17，P<0.05)，NaHS組的nNOS mRNA表達(dá)(0.96±0.27)低于嗎啡依賴組(P<0.05)，而NaHS組與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠戒斷癥狀評(píng)分和體重變化比較±s)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與嗎啡依賴組比較:2)P<0.05，下表同

表2 各組大鼠血漿及海馬組織NO含量比較

3 討 論

而近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)H2S在機(jī)體內(nèi)廣泛存在，具有重要的細(xì)胞保護(hù)作用。最近的研究表明，使用H2S的海洛因成癮大鼠戒斷癥狀明顯低于單獨(dú)使用海洛因組大鼠，外源性NaHS可以抑制腺苷酸環(huán)化酶/cAMP途徑，影響海洛因依賴大鼠伏隔核cAMP信號(hào)通路〔6〕，提示H2S及其同系物對(duì)嗎啡依賴有積極作用，有望開(kāi)發(fā)成為一種新型的防治阿片類物質(zhì)依賴的藥物，但其作用機(jī)制及應(yīng)用前景尚有待于進(jìn)一步研究和證實(shí)。

課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)外源性硫氫化鈉可提高嗎啡依賴大鼠血漿H2S含量，降低伏核和海馬cAMP含量，減輕嗎啡依賴大鼠學(xué)習(xí)記憶減退及海馬神經(jīng)元損傷〔7～9〕。近年來(lái)的研究也發(fā)現(xiàn)H2S作為一種神經(jīng)調(diào)節(jié)因子，能有效緩解神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，并能減輕相應(yīng)臨床癥狀。本研究結(jié)果提示外源性H2S可減輕嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀及體質(zhì)量變化，由此推測(cè)將H2S或者同系物開(kāi)發(fā)成為一種新型的防治阿片類物質(zhì)依賴的藥物成為可能。

近年來(lái)，已經(jīng)證實(shí)NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著細(xì)胞間信息傳導(dǎo)的作用，能夠介導(dǎo)許多生理和病理過(guò)程，其中包括參與嗎啡的耐受和依賴過(guò)程。在對(duì)阿片類物質(zhì)濫用的研究中證實(shí)，阿片濫用者血清NO含量高于普通人群，因此有研究者認(rèn)為NO可能介導(dǎo)了阿片類物質(zhì)依賴和耐受的形成〔10〕。NOS作為NO生物合成的關(guān)鍵酶，不同的NOS催化合成的NO在不同的組織細(xì)胞中發(fā)揮著不同的生物學(xué)效應(yīng)。以往實(shí)驗(yàn)研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的NO在嗎啡依賴和戒斷的形成中通過(guò)NMDA/NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生效應(yīng)，其中神經(jīng)元型NO合酶(nNOS)的活性直接影響此通路中NO的合成〔11〕，提示中樞內(nèi)NO和nNOS在嗎啡依賴和戒斷的形成中可能發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)嗎啡依賴大鼠血漿和海馬組織NO含量顯著增高，海馬組織的nNOS mRNA表達(dá)增加，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果是一致的。然而給予外源性H2S供體NaHS后，大鼠血漿和海馬組織NO含量以及海馬nNOS mRNA表達(dá)均低于嗎啡依賴組。由此推測(cè)，H2S減輕嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的原因，可能是由于H2S抑制了以上基因的表達(dá)，當(dāng)然也有可能是與其他因素相互作用的結(jié)果。

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〔2015-03-13修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目(No.20083066)；貴州省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(No.gzwkj2013-1-013)；遵義醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(No.XZXK-20120702)

秦 偉(1976-)，男，副教授，碩士，主要從事阿片成癮及神經(jīng)疾病的研究。

R915；Q423

A

1005-9202(2015)12-3235-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.021