張風華 彭和平 王寶枝

(廣州醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院普外科，廣東 廣州 511447)

ART1基因的表達對小鼠結(jié)腸癌CT26細胞轉(zhuǎn)移潛能的影響及可能作用機制

張風華 彭和平 王寶枝

(廣州醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院普外科，廣東 廣州 511447)

目的 探討ART1基因的表達對小鼠結(jié)腸癌CT26細胞轉(zhuǎn)移潛能的影響及可能作用機制。方法 將ART1-shRNA轉(zhuǎn)入到小鼠結(jié)腸癌CT26細胞，置于熒光顯微鏡下觀察該病毒的轉(zhuǎn)染效率；采用RT-PCR和Western印跡法鑒定ART1基因沉默的效果；采用侵襲實驗及黏附實驗觀察CT26細胞受ART1基因沉默的影響，并采用明膠酶譜法測定對該細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白活性的影響。結(jié)果 病毒感染4 d后ART1 mRNA 的表達量在ART1-shRNA 組中明顯低于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)。ART1-shRNA組CT26細胞的ART1蛋白的表達量明顯低于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)。ART1-shRNA組CT26細胞數(shù)明顯少于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)；ART1-shRNA組的侵襲抑制率與陰性對照組和空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與陰性對照組和空白對照組相比，RT1-shRNA 組CT26細胞與纖維連接蛋白的黏附能力均明顯降低(P<0.01)。RT1-shRNA 組CT26細胞中RhoA/Rho相關(guān)螺旋卷曲形成蛋白激酶(ROCK1)、RhoA、MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯低于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)。結(jié)論 ART1基因沉默能夠?qū)е滦∈蠼Y(jié)腸癌CT26細胞的侵襲和黏附力降低，可能與ART1基因沉默后ROCK1、RhoA、MMP-2、MMP-9的表達水平下調(diào)有關(guān)。說明ART1基因在結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。

結(jié)腸癌；ART1基因；Rho相關(guān)激酶類；CT26細胞

腺苷二磷酸(ADP)核糖轉(zhuǎn)移酶ART1對蛋白質(zhì)精氨酸殘基的單-ADP-核糖基化作用起到特異性催化效果，且在人、小鼠、大鼠中均有表達〔1〕。間位碘代芐胍(MIBG)為ART1的特異性抑制劑。相關(guān)研究顯示，結(jié)腸癌組織中ART1蛋白的表達明顯高于正常腸黏膜組織，且與整合素(αVβ3)和血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的表達之間有明顯的相關(guān)性〔2〕。本研究擬探討ART1基因沉默后對CT26細胞中RhoA/Rho相關(guān)螺旋卷曲形成蛋白激酶(ROCK)1、RhoA、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表達的影響，及其對結(jié)腸癌侵襲力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 小鼠結(jié)腸癌CT26細胞購于上海通派生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購于美國CORNING公司；胎牛血清購于美國SIGMA公司；ART1基因直接轉(zhuǎn)染的病毒載體購于上海吉凱基因公司；RT-PCR試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司；青鏈霉素雙抗，兔抗小鼠多克隆ART1、ROCK1、RhoA、MMP-2、MMP-9、β-actin抗體，均購于上海博湖生物科技有限公司；增強化學發(fā)光試劑盒購于德國merck公司；明膠、TritonX-100、八肽膽囊收縮素(CCK-8)均購于上海江萊生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及ART1-shRNA轉(zhuǎn)染 用含10%的胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠結(jié)腸癌CT26細胞。實驗分為vshART1慢病毒載體(ART1-shRNA組)、negative-shRNA 慢病毒載體(陰性對照組)、未轉(zhuǎn)染組(空白對照組)。轉(zhuǎn)染過程嚴格按照說明書進行，取對數(shù)生長期CT26細胞，每孔接種3×104個細胞，觀察細胞生長的融合度達到50%之后，按照MOI值為20時，每孔中分別加入慢性病毒1×108TU/ml進行感染，4 d后觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.3 ART1基因沉默情況鑒定 采用RT-PCR進行鑒定，各組均取感染4 d后的細胞，用Trizol試劑盒提取各組細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進一步擴增對ART1 mRNA的表達情況；擴增產(chǎn)物采用凝膠電泳進行鑒定，并在凝膠成像儀中拍照。

1.4 細胞侵襲實驗 8 μm孔的小室采用Matrigel包被，放于4℃環(huán)境中過夜；向下室中加入500 μl濃度為10%的胎牛血清，上室中加入200 μl含5×105個細胞的懸液，培養(yǎng)24 h后，將上室細胞棄去，細胞固定后用結(jié)晶紫染色，隨機選取5個視野，計數(shù)完整細胞。本次實驗各組均設(shè)置3個復室。

1.5 細胞黏附實驗 10 mg/L濃度的纖維連接蛋白包被96孔板，4℃條件下放置12 h。用含有1%胎牛血清白蛋白的封閉液在室溫條件下封閉2 h，使用酶標儀在450 nm波長處檢測吸光度，重復實驗3次，計算細胞黏附抑制率。

1.6 明膠酶譜 取三組對數(shù)生長期的CT26細胞分別接種于6孔板中，當細胞生長至80%及以上時，換用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)1 d，取上清，4℃條件下離心15 min，置于-80℃超低溫冰箱中保存待測；確保三組質(zhì)量相等后，4℃環(huán)境下行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)恒壓電泳，電壓設(shè)定為100 V，取含72 kD、92 kD的凝膠放入3.0%TritonX-100的洗脫液中，洗脫完全后放入孵育液中42 h，考馬斯亮藍染色后采集圖像，均重復進行3次。

1.7 Western印跡檢測蛋白表達 抽提結(jié)腸癌CT26細胞中蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。調(diào)整三組蛋白總量一致后行SDS-PAGE電泳，分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用含有5%的脫脂奶粉在室溫條件下密封保存1 h，加入一抗，4℃反應(yīng)12 h，采用Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜后加入羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗，4℃反應(yīng)1 h，分析條帶灰度值并計算內(nèi)參與各蛋白的灰度值之比，均重復3次。

1.8 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件行方差分析和t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 ART1基因沉默效率鑒定 病毒感染4 d后，ART1-shRNA 組、陰性對照組均獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞，細胞中GFP水平均達≥80%。RT-PCR檢測顯示，ART1-shRNA 組細胞中ART1 mRNA 表達量(0.021±0.009)明顯低于陰性對照組(0.246±0.081)和空白對照組(0.298±0.069)(P<0.01)。Western印跡檢測顯示，ART1-shRNA 組的CT26細胞的ART1蛋白的表達量明顯低于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)。見圖1。

2.2 ART1基因沉默對CT26細胞中ROCK1、RhoA、MMP-2、MMP-9蛋白表達影響 如圖2所示，RT1-shRNA組CT26細胞中ROCK1、RhoA、MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯低于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)。

2.3 ART1基因沉默對CT26細胞侵襲力影響 ART1-shRNA組CT26細胞數(shù)明顯少于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)；ART1-shRNA組與陰性對照組和空白對照組相比侵襲抑制率分別為40.02%、43.64%(P<0.05)。

2.4 ART1基因沉默對CT26細胞黏附能力的影響 ART1-shRNA組CT26細胞與纖維連接蛋白的黏附抑制率為41.572%，陰性對照組黏附抑制率3.148%。ART1-shRNA 組CT26細胞與纖維連接蛋白的黏附能力明顯低于陰性對照組與空白對照組(P<0.01)。

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：ART1-shRNA組

圖3 三組CT26細胞侵襲力情況(×200)

3 討 論

ART1能夠?qū)θ朔烙?1、整合素α7β1、(FGF)-2、(PDGF)-BB四種蛋白進行直接修飾，其中人防御素-1、FGF-2、PDGF-BB為分泌性蛋白，主要與機體中血管生成、免疫反應(yīng)、細胞生長相關(guān)；整合素α7β1為跨膜蛋白的一種〔3〕。相關(guān)研究認為，整合素α7β1為能夠誘導MCF-7乳腺癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，還與黑色素細胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)〔4〕。整合素β1結(jié)合胞外基質(zhì)后可上調(diào)RhoA，進一步將RhoA/ROCK通路激活〔5〕。

Rho家族為Ras超家族，RhoA為其中一個重要組成，ROCK1是Ras超家族的下游效應(yīng)因子。細胞骨架和RhoA/ROCK通路之間存在密切關(guān)系，可對細胞運動能力造成明顯影響〔6〕。MMP-2、MMP-9能夠使細胞外基質(zhì)降解，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。研究顯示，用ROCK抑制劑對膀胱癌細胞進行處理，能夠通過下調(diào)MMP-2、MMP-9表達來抑制RhoA對TSGH 細胞遷移的誘導作用〔7〕，提示激活RhoA/ROCK通路能夠使MMP-2、MMP-9表達上調(diào)。本研究說明ART基因沉默可下調(diào)ART1的表達水平，進一步下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達，使活性下降，進而對結(jié)腸癌CT26細胞的遷徙和侵襲能力產(chǎn)生了明顯影響。以上結(jié)果的可能機制與抑制RhoA/ROCK通路有關(guān)，但其能否通過降低對整合素α7β1的翻譯后修飾，進而影響下游通路MMP-2、MMP-9、RhoA/ROCK的表達，還需要進一步深入研究。

1 徐劍俠.ART1對小鼠結(jié)腸癌CT26細胞增殖的影響及其相關(guān)機制探討〔D〕.重慶：重慶醫(yī)科大學碩士論文，2013.

2 熊 薇,唐 怡,王婭蘭,等.ART1基因沉默對小鼠結(jié)腸癌CT26細胞黏附和運動能力的影響〔J〕.復旦學報(醫(yī)學版),2013;40(3):328-34.

3 董天庚,牛偉新,洪信強,等.聯(lián)合激動Toll樣受體的樹突細胞對小鼠結(jié)腸癌生長的影響〔J〕.中華實驗外科雜志,2012;29(2):181-3.

4 蔡 莉,王婭蘭,林 曉,等.PARP抑制劑5-AIQ對小鼠結(jié)腸癌CT26細胞PARP/NF-κB復合物和NF-κB活性的影響〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床,2008;28(11):1156-9.

5 楊 怡,王婭蘭,王潔瓊,等.PARG基因沉默對小鼠結(jié)腸癌CT26細胞肝轉(zhuǎn)移影響〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床,2012;32(10):1132-6.

6 吳偉強,王婭蘭,潘 娟,等.PARG基因沉默抑制小鼠結(jié)腸癌CT26細胞系體外淋巴管形成〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床,2011;31(6):625-9.

7 李 喆,趙 平,王建軍,等.核糖核酸干擾抑制生存素表達誘導小鼠結(jié)腸癌細胞凋亡〔J〕.中華實驗外科雜志,2006;23(7):792-4.

〔2014-07-16修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

張風華(1975-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事結(jié)腸癌治療基礎(chǔ)研究。

R735

A

1005-9202(2015)12-3233-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.020