鐘 健 劉 麗 劉大晟 徐云生 吳先林

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510632)

桃核承氣湯對重癥急性胰腺炎模型大鼠炎癥因子的調(diào)控作用及機(jī)制

鐘 健 劉 麗1劉大晟2徐云生3吳先林4

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510632)

目的 探討重癥急性胰腺炎(SAP)模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)炎性因子的變化情況及桃核承氣湯對其影響和作用機(jī)制。方法 將90只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、SAP模型組、桃核承氣湯組、奧曲肽組、桃核承氣湯+奧曲肽組。除空白對照組外，其余各組采用20% L-精氨酸腹腔注射制備大鼠SAP模型，每組于12、24、48 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)各處死6只大鼠，采用ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10表達(dá)水平，生化分析儀檢測血清淀粉酶(AMY)、Ca2+水平，采用HE染色觀察胰腺病理變化。結(jié)果 與空白對照組相比，SAP模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平均顯著升高(P<0.05)；三個(gè)治療組與SAP模型組各檢測標(biāo)本組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且胰腺出血壞死及炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕(P<0.05)；桃核承氣湯、奧曲肽對減輕SAP大鼠炎癥因子及胰腺病理變化的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但兩藥合用不存在交互作用(P>0.05)。結(jié)論 桃核承氣湯能明顯減少SAP大鼠TNF-α、IL-6等炎性因子的釋放，提高IL-10水平，從而減輕炎癥反應(yīng)并對胰腺及機(jī)體起到保護(hù)作用，抑制SAP病情的發(fā)展。

重癥急性胰腺炎；桃核承氣湯；炎癥因子；L-精氨酸

重癥急性胰腺炎(SAP)以胰腺出血壞死多見，常繼發(fā)感染、腹膜炎和休克等多種并發(fā)癥，病死率高達(dá)30%～40%〔1〕。若炎癥介質(zhì)級聯(lián)效應(yīng)失控，可使炎癥效應(yīng)放大，迅速導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)，并可進(jìn)一步發(fā)展為多器官衰竭綜合征(MODS)。比較重要的促炎癥因子有腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6及抗炎癥因子IL-10。SAP中醫(yī)辨證為氣血同病，瘀熱互結(jié)，因此治療上可予桃核承氣湯通腑瀉熱、活血化瘀。為探討桃核承氣湯對SAP的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬檢測不同處理方式、不同時(shí)段TNF-α、IL-10、IL-6水平，從而為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物制備 將L-精氨酸(sigma公司)90 g溶于450 ml生理鹽水中，攪拌加熱至30℃，調(diào)pH至7.0，配成20%的L-精氨酸溶液；桃核承氣湯生藥材購自廣東和翔制藥公司，將桃仁24 g，生大黃24 g，桂枝12 g，芒硝12 g，甘草12 g進(jìn)行煎煮，大黃后下，芒硝溶解，水煎配成200 ml含有42 g生藥材的桃核承氣湯；將奧曲肽注射液100 μg(Novartis Pharma AG公司)溶于0.9%生理鹽水中，配置成4 μg/ml的奧曲肽注射液。以上試劑均4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組 SD雄性大鼠90只，SPF級，體重180～220 g，購于廣東省動物實(shí)驗(yàn)中心，遵循12 h光照/12 h黑暗周期飼養(yǎng)于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理中心，自由進(jìn)食和飲水。適應(yīng)環(huán)境1 w后，將大鼠隨機(jī)分為空白對照組、SAP模型組、桃核承氣湯組、奧曲肽組、桃核承氣湯+奧曲肽組，每組18只。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物處理 采用20% L-精氨酸按0.25 g/100 g體重腹腔注射2次，間隔1 h，除空白對照組外，其余各組大鼠進(jìn)行SAP模型制備，空白對照組大鼠予以0.9%生理鹽水按相同的方法腹腔注射。模型制備后即刻、6、12、24、30、36 h，空白對照組、SAP模型組大鼠僅予以觀察處理；桃核承氣湯組大鼠予以濃度為21%的桃核承氣湯按每天2.35 ml/100 g灌胃，給藥劑量參照郝光榮〔2〕主編的《實(shí)驗(yàn)動物學(xué)》中常用實(shí)驗(yàn)動物及人的體表面積比例進(jìn)行換算得出；奧曲肽組大鼠予以奧曲肽注射液按體重1 μg/100 g背部皮下注射；桃核承氣湯+奧曲肽組大鼠予以濃度為21%的桃核承氣湯按每天2.35 ml/100 g灌胃及奧曲肽按體重1 μg/100 g背部皮下注射。

1.4 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集與檢測 各組實(shí)驗(yàn)動物予以相應(yīng)處理后，于第12、24、48小時(shí)，每組隨機(jī)取大鼠6只，采用異氟烷吸入麻醉，麻醉后開腹從心臟取血(量約6 ml)制備血清，采用ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-10，于酶標(biāo)儀上讀取樣品各孔的OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線算出其濃度，同時(shí)對血清淀粉酶(AMY)、血清鈣離子(Ca2+)進(jìn)行測定。取胰腺組織(0.6 cm×0.6 cm)浸于4%的多聚甲醛溶液中做常規(guī)石蠟切片、HE染色，并采用改良Kusske評分標(biāo)準(zhǔn)對胰腺組織進(jìn)行病理評分。

2 結(jié) 果

2.1 各組化驗(yàn)指標(biāo)測定結(jié)果及胰腺病理評分比較 SAP模型組與空白對照組比較，大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α、IL-6、IL-10、AMY、水平及胰腺病理評分明顯升高，Ca2+水平明顯降低(P<0.05)，且L-精氨酸對大鼠實(shí)驗(yàn)標(biāo)本測定結(jié)果的影響與時(shí)間有關(guān)(P<0.05)。三個(gè)治療組各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清TNF-α、IL-6、AMY水平較SAP模型組明顯降低，IL-10、Ca2+水平及胰腺病理評分較之明顯升高(P<0.05)。桃核承氣湯、奧曲肽對除AMY外的指標(biāo)不存在交互作用(P>0.05)，但兩藥合用明顯有相加作用。給藥時(shí)間對大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10、AMY、Ca2+及胰腺病理評分測定結(jié)果的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但時(shí)間、桃核承氣湯、奧曲肽三因素之間不存在交互作用(P>0.05)。見表1。

表1 各組血清TNF-α、IL-6、IL-10、AMY、Ca2+水平及胰腺病理評分測定結(jié)果

2.2 胰腺病理形態(tài)學(xué)結(jié)果 空白對照組結(jié)構(gòu)完整，無細(xì)胞水腫，胰管走行正常，未見小葉間間隙增寬，無出血壞死，偶見炎癥細(xì)胞。SAP模型組胰腺結(jié)構(gòu)彌漫性破壞，細(xì)胞腫脹，彌漫性小葉間水腫，實(shí)質(zhì)出血明顯，片狀壞死細(xì)胞，大量炎癥細(xì)胞浸潤，隨時(shí)間增長而進(jìn)行性加重。桃核承氣湯、奧曲肽組胰腺結(jié)構(gòu)欠清，間質(zhì)水腫減輕，腺泡壞死減少，炎癥細(xì)胞浸潤較SAP組減少。桃核承氣湯+奧曲肽組胰腺結(jié)構(gòu)欠清，彌漫性小葉間水腫，出血壞死灶及炎癥細(xì)胞較單獨(dú)用藥組減輕。三個(gè)治療組胰腺組織病理學(xué)顯示24 h組最重，48 h組有所減輕，見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理改變(HE，×200)

3 討 論

SAP無論病因如何，最終結(jié)果總是胰腺出血壞死和全身炎性反應(yīng)，與炎性因子的過度生成有關(guān)。多種炎性因子發(fā)生瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)，引起SAP炎癥擴(kuò)散，導(dǎo)致SIRS、MODS，甚至死亡。與SAP 發(fā)生有關(guān)的炎性因子包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、血小板活化因子等，抗炎性細(xì)胞因子包括TGF-B和IL-10等〔3〕，它們之間相互關(guān)聯(lián)，相互影響。TNF-α是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生最早和最核心的炎癥介質(zhì)，具有早期迅速合成釋放的特點(diǎn)〔4〕，它在促進(jìn)炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面具有重要的作用，其主要機(jī)制為誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量炎癥因子，反過來又可導(dǎo)致其自身水平升高，形成“瀑布樣”炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致局部微循環(huán)障礙，進(jìn)一步加重胰腺的損傷。因此，TNF-α既為原始促炎遞質(zhì)，又是繼發(fā)性炎性因子的趨化因子〔5〕。IL-6是應(yīng)激反應(yīng)中重要的細(xì)胞因子，并受TNF-α的調(diào)控。IL-6在急性胰腺炎發(fā)病1 h后即可升高，比C反應(yīng)蛋白升高早24～36 h，特別在SAP早期階段發(fā)揮重要作用〔6〕。IL-10是一種重要的炎癥負(fù)反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，具有很強(qiáng)的抗炎作用，能抑制TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子的合成，抑制炎性細(xì)胞在胰腺聚集，體內(nèi)IL-10低下提示免疫系統(tǒng)功能降低，是對SAP預(yù)后有重要價(jià)值的早期預(yù)測指標(biāo)。SAP時(shí)促炎因子TNF-α、IL-6升高，而抗炎因子IL-10顯著下降，導(dǎo)致體內(nèi)抗炎因子與促炎因子的失衡，與SAP 的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。中醫(yī)文獻(xiàn)中雖無細(xì)胞炎癥因子一說，但在SAP病因病機(jī)演變過程中產(chǎn)生濕、熱、痰、瘀等各種病理產(chǎn)物，其相互作用導(dǎo)致SAP病情發(fā)展迅速，逐漸加重，與炎性因子作用類似。SAP在其發(fā)病過程中，胰腺內(nèi)的胰脂肪酶從胰腺腺泡中溢出，水解生成脂肪酸，脂肪酸與血液中Ca2+結(jié)合形成不溶性的脂肪酸鈣，導(dǎo)致Ca2+水平下降，因此Ca2+水平是SAP病情嚴(yán)重程度評價(jià)的重要指標(biāo)。

對SAP的治療，西藥主要是抑制胰酶分泌、減輕胰腺組織自身消化、抑制炎癥反應(yīng)等，中醫(yī)則多采用通腑泄熱法，如何將中西醫(yī)結(jié)合的治療作用發(fā)揮最大化，一直是臨床和實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)和方向?！堆C論·瘀血》認(rèn)為：“世謂血塊為瘀，清血非瘀；黑色為瘀，鮮血非瘀，此論不確。蓋血初離經(jīng)，清血也，鮮血也，然即是離經(jīng)之血，雖清血鮮血，亦是瘀血”。本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為SAP的治療應(yīng)活血化瘀與通腑泄熱并舉，化瘀宜早不宜遲，化瘀愈早，效果愈佳。程夢琳等〔7〕發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予桃核承氣湯可通過減輕炎癥反應(yīng)對大鼠腸缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)在大鼠SAP模型制備完成后，立即給予桃核承氣湯、奧曲肽單獨(dú)治療及桃核承氣湯和奧曲肽聯(lián)合用藥治療。

奧曲肽是人工合成的八肽環(huán)狀化合物，可抑制胰酶分泌，減少炎性介質(zhì)產(chǎn)生，改善胰腺微循環(huán)，作用較天然生長抑素持久，已在臨床中廣為施用。桃核承氣湯出自張仲景《傷寒論》，該方由桃仁、大黃、芒硝、桂枝、炙甘草組成，張仲景論桃核承氣湯主治病證，既論病變部位 “熱結(jié)膀胱”，又論病證在心而為發(fā)狂，旨在闡明運(yùn)用桃核承氣湯的核心不在于辨病變部位，而是突出審明病變證機(jī)，亦即運(yùn)用桃核承氣湯無論其病變部位在下焦還是在上焦，只要審明病變證機(jī)是“瘀熱”，即可以法用之〔8〕。同時(shí)，蘭萬成等〔9〕通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)桃核承氣湯可顯著降低膿毒癥患者血清IL-6、TNF-α，抑制炎癥反應(yīng)。劉云濤等〔10〕研究表明，桃核承氣湯可明顯減輕膿毒癥大鼠小腸組織炎性損傷，其機(jī)制可能通過作用于TLR 信號通路，減少TLR4 mRNA 和CD4 mRNA 表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)TNF-α、IL-6 等炎癥因子有關(guān)。

如今，桃核承氣湯也被應(yīng)用于如SAP、膿毒血癥感染導(dǎo)致的器官功能障礙等急重癥的治療。其中，桃仁活血通便、化瘀生新，大黃通腑瀉熱、逐瘀通經(jīng)，二者共為君藥。桂枝通經(jīng)活血，又可防寒藥遏邪凝瘀之弊，芒硝咸寒軟堅(jiān)，助大黃攻逐瘀熱，同為臣藥，炙甘草益氣和中，緩諸藥峻烈之性，以防逐瘀傷正，為使藥，五藥相輔相成，共行通腑瀉熱、活血化瘀之功，有效地改善胰腺微循環(huán)?，F(xiàn)代研究表明桃仁具有抑制血液凝固，穩(wěn)定血液流變，抗血栓的作用，其提取物具有抗炎和促進(jìn)炎癥吸收的作用；大黃、芒硝具有抗感染作用，可對腸道細(xì)菌移位及內(nèi)毒素定植起到防御作用，并維持腸道菌群平衡，抑制胰液分泌，王林等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)大黃的主要成分大黃素可明顯降低大鼠TNF-α、IL-8 水平，有效減輕胰腺損害；桂枝不僅可以抑制血小板聚集、抗凝血，桂枝揮發(fā)油對急慢性和免疫損傷性炎癥均有顯著拮抗作用，其作用與影響炎癥介質(zhì)生成有關(guān)〔12〕；甘草對體內(nèi)代謝產(chǎn)物中毒及細(xì)菌毒素均有一定的解毒作用。因此，桃核承氣湯可通過活血化瘀、通腑瀉熱改善胰腺微循環(huán)，降低血管通透性，減輕內(nèi)毒素所致的損傷和破壞，對炎癥反應(yīng)起到良好的抑制作用，進(jìn)而減輕組織損害及炎癥侵入，有效抑制TNF-α、IL-6等促炎因子的過度分泌，上調(diào)抗炎介質(zhì)IL-10的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明桃核承氣湯、奧曲肽可有效抑制SAP病情的進(jìn)展，并且桃核承氣湯和奧曲肽聯(lián)合用藥明顯優(yōu)于單獨(dú)用藥。

綜上所述，桃核承氣湯對SAP大鼠具有良好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過改善胰腺微循環(huán)，降低胰腺壞死程度，減輕SAP大鼠組織炎性損傷，進(jìn)而下調(diào)促炎性因子TNF-α、IL-6水平，升高抗炎性細(xì)胞因子IL-10水平，在重建促炎和抗炎細(xì)胞因子中發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，從而減輕胰腺壞死程度，阻止SAP進(jìn)一步惡化。

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〔2013-10-17修回〕

(編輯 徐 杰)

Mechanism of Taohechengqi decoction on inflammatory factors in severe acute pancreatitis rat model

ZHONG Jian， LIU Li， LIU Da-Sheng，etal.

Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou 510632,Guangdong,China

Objective To explore inflammatory factor changes on SAP rat in different time points and the effects，mechanism of Taohechengqi decoction.Methods 90 SPF SD male rats were randomly divided into blank control,SAP model,Taohechengqi decoction treated,octreotide treated,Taohechengqi decoction and octreotide combination treated groups. At the time of 12,24,48 h,each group was executed 6 rats. The serum TNF-α,IL-6,IL-10 levels were obtained by ELISA,the contents of AMY,Ca2+were measured by biochemical indicators and pathological changes were observed by HE staining.Results Serum TNF-α,IL-6,IL-10 levels were significantly increased in SAP model group compared to those of blank control(P<0.05). There were significant differences between SAP treated and SAP model group,and pancreas hemorrhage necrosis and inflammatory cells infiltration were significantly reduced(P<0.05).There were significant differences in the effect of Taohechengqi decoction and octreotide treatment on inflammatory factors and pancreatic pathological changes(P< 0.05),but with no combined interaction(P>0.05).Conclusions Taohechengqi decoction could reduce inflammatory factors,such as IL-6,TNF-α and increase anti-inflammatory factor IL-10 expressions in SAP rats. Then,it could relieve acute systemic inflammation and protect the pancreas of SAP rat,and hinder the development of SAP condition.

Severe acute pancreatitis；Taohechengqi decoction；Inflammatory factor；L-arginine

國家自然科學(xué)基金資助(No.81403302)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(No.21614306)；廣東省自然科學(xué)基金資助(2014A030310477)

吳先林(1984-)，男，博士，助理研究員，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治胰腺病研究。

鐘 健(1961-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事消化內(nèi)科疾病診治研究。

R57

A

1005-9202(2015)12-3223-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.016

1 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院校門診部

2 廣東省中醫(yī)院血管甲狀腺外科

3 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系

4 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院胰腺病診治中心