周風(fēng)華 劉煥彩 陳燕春 鞠 杰 蒲雷東 王巧真 接琳琳 丁昊宇

(濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053)

自噬相關(guān)基因Atg4B及LC3-Ⅱ在肌萎縮側(cè)索硬化癥轉(zhuǎn)基因鼠海馬中的表達(dá)及意義

周風(fēng)華 劉煥彩1陳燕春2鞠 杰2蒲雷東2王巧真2接琳琳2丁昊宇2

(濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053)

目的 觀察自噬相關(guān)基因Atg4B及LC3-Ⅱ在肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)轉(zhuǎn)基因鼠海馬組織中的表達(dá)變化，探討細(xì)胞自噬機(jī)制在ALS發(fā)病中的作用及意義。方法 選擇SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行試驗，分別于發(fā)病早、中、晚期，通過RT-PCR、免疫熒光檢測小鼠海馬組織中Atg4B、LC3-Ⅱ在mRNA、蛋白水平的表達(dá)及變化。結(jié)果 與野生型鼠相比較，轉(zhuǎn)基因鼠的Atg4B在mRNA及蛋白水平表達(dá)均下調(diào)；LC3-Ⅱ在蛋白水平表達(dá)上調(diào)，在mRNA水平變化不明顯。結(jié)論 自噬相關(guān)基因Atg4B及LC3-Ⅱ參與了ALS發(fā)病，ALS海馬組織的病變與自噬異常有關(guān)。

自噬；ALS；Atg4B；LC3-Ⅱ

肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種選擇性上、下運動神經(jīng)元進(jìn)行性變性為主要特征的神經(jīng)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性全身肌肉無力，多數(shù)患者在發(fā)病3～5年內(nèi)死于呼吸衰竭〔1〕。除運動系統(tǒng)功能障礙外，部分ALS患者可出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能等行為學(xué)損害〔2〕因而ALS的發(fā)展可能與海馬結(jié)構(gòu)有關(guān)〔3〕。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象〔4〕，參與人體的多種生理及病理過程。Atg4B及LC3-Ⅱ是兩個重要的自噬相關(guān)基因，參與了自噬體的形成。Morimoto等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，ALS的發(fā)病與細(xì)胞自噬有關(guān)，而自噬基因Atg4B及LC3-Ⅱ在ALS海馬中的表達(dá)變化及作用尚無明確報道。本實驗通過檢測Atg4B及LC3-Ⅱ在ALS轉(zhuǎn)基因鼠海馬組織中的表達(dá)變化，探討細(xì)胞自噬在ALS發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型及標(biāo)本處理 野生型及突變型SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson Laboratories。該動物模型攜帶有突變的SOD1基因，能夠模擬人類ALS的疾病進(jìn)展及臨床表現(xiàn)，是研究ALS疾病的理想動物模型。嚴(yán)格按轉(zhuǎn)基因鼠飼養(yǎng)條件進(jìn)行飼養(yǎng)，成年鼠按雌雄比1∶1進(jìn)行合籠，出生后的小鼠約30 d后，提取鼠尾DNA，基因擴(kuò)增進(jìn)行野生型及突變型小鼠鑒定。選取突變型成年鼠18只，隨機(jī)分為發(fā)病早期(生后約95 d)、發(fā)病中期(出生后約108 d)、發(fā)病晚期(出生后約122 d)。每個時間點選3只鼠進(jìn)行4%多聚甲醛灌注固定，剝離大腦，30%蔗糖脫水，冰凍切片，進(jìn)行免疫熒光檢測；每個時間點選3只鼠拉頸處死，剝離海馬，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RT-PCR檢測；以相同數(shù)量的同窩野生型鼠作為對照組。

1.2 主要試劑 兔抗多克隆抗體Atg4B，anbo公司；LC3-Ⅱ，Abcam公司；Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG，美國Jackson Immuno Research Laboratoris；RT-PCR試劑盒，北京天根生化科技有限公司；OligdT，美國Promega公司；5×逆轉(zhuǎn)錄Buffer，美國Promega公司；M-MlV逆轉(zhuǎn)錄酶，美國Promega公司。

1.3 免疫熒光標(biāo)記 將冰凍切片室溫晾片2 h，滴加10%山羊血清，37℃封閉40 min，分別滴加兔抗多克隆抗體Atg4B、LC3-Ⅱ(濃度均為1∶100)，4℃孵育過夜，滴加Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG熒光二抗(濃度為1∶400)，避光37℃孵育30 min，滴加終濃度為10 μg/ml的Hoechst33258，避光37℃孵育15 min，防淬滅熒光封片劑封片，用熒光顯微鏡觀察Atg4B及LC3-Ⅱ表達(dá)情況。實驗過程中的沖洗緩沖液均為0.01 mol/L的PBS緩沖液。

1.4 RT-PCR (1)總RNA的提取:取大腦海馬組織，加入500 μl TRIzol，冰上充分勻漿，具體步驟參照文獻(xiàn)〔6〕。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)：Atg4B上游引物：5′TACAGCATTTTCACAGAGAAGGACG 3′，Atg4B下游引物：5′CTCCAGCAGGGAACCCATTAC3′。LC3-Ⅱ上游引物：5′CCCAGTGATTATAGAGCGATACAAG3′，LC3-Ⅱ下游引物：5′TGTCTCCTGCGAGGCATAAAC3′。以1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，2×Taq PCR Mastermix 10 μl。Atg4B、LC3-Ⅱ上下游引物分別各0.5 μl，β-actin上游引物、下游引物各0.3 μl，分別組成PCR反應(yīng)體系。PCR儀中運行以下程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次，72℃延伸5 min后冷卻至4℃。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用IPP5.1圖像分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。測量Atg4B及LC3-Ⅱ免疫熒光圖片陽性細(xì)胞累積光密度(IOD)值。測量RT-PCR顯示的mRNA擴(kuò)增帶與β-actin擴(kuò)增帶的IOD值。用SPSS20.0軟件行獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 Atg4B在海馬組織中的表達(dá) 免疫熒光檢測顯示，在野生型及突變型小鼠海馬組織中，均檢測到Atg4B陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞主要分布在海馬的DG區(qū)，CA可見少量陽性細(xì)胞。與野生型小鼠比較，在發(fā)病的早期，突變型小鼠Atg4B陽性細(xì)胞累積光密度變化不明顯，而在發(fā)病中、晚期，突變型小鼠Atg4B陽性細(xì)胞累積光密度在DG區(qū)明顯降低(68.5±5.2 vs 32.3±2.6,P<0.05)，CA區(qū)陽性細(xì)胞累積光密度變化不明顯(P>0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，與野生型小鼠比較，在發(fā)病的早(61.2±5.7 vs 58.2±7.2)、中(60.1±5.2 vs 38.5±4.7)、晚期(59.5±4.2 vs 39.7±3.5)，突變型小鼠Atg4B mRNA水平明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖1，圖2。

圖1 Atg4B在突變型小鼠122 d海馬組織中的表達(dá)(標(biāo)尺=50 μm)

圖2 Atg4B在突變型小鼠發(fā)病早、中、晚期mRNA表達(dá)變化

圖3 LC3-Ⅱ在突變型小鼠122 d海馬組織中的表達(dá)(標(biāo)尺=50 μm)

圖4 LC3-Ⅱ在突變型小鼠發(fā)病早、中、晚期mRNA表達(dá)變化

2.2 LC3-Ⅱ在海馬組織中的表達(dá)呈上調(diào)趨勢 免疫熒光檢測顯示，在野生型及突變型小鼠海馬組織中，均檢測到LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞主要分布在海馬的DG區(qū)。與野生型小鼠比較，在發(fā)病的早期，突變型鼠LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞累積光密度變化不明顯，在發(fā)病的中、晚期，突變型鼠LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞累積光密度明顯增加(62.5±6.1 vs 35.3±4.5,P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，與野生型小鼠比較，在發(fā)病的早(36.5±4.2 vvs 34.1±5.3)、中(38.3±5.1 vs 39.1±4.3)、晚期(40.5±5.6 vs 39.8±4.2)，突變型小鼠LC3-Ⅱ mRNA水平變化不明顯(P>0.05)，見圖3，圖4。

3 討 論

自噬是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象〔4〕，參與人體的多種生理及病理過程。有研究報道，自噬與阿爾茨海默病(AD)、亨廷頓舞蹈病(HD)和帕金森病(PD)等多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)〔6〕。在這些神經(jīng)退行性疾病中，自噬可能通過清除異常折疊的蛋白而延緩疾病的進(jìn)展。尸體剖驗及動物實驗均證實在ALS脊髓組織中自噬小體的數(shù)量增加〔5〕，提示在ALS發(fā)病中自噬被激活，但目前自噬的激活機(jī)制及意義尚未完全闡明。

微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)是哺乳動物細(xì)胞中酵母8(Atg8)基因的同源物，參與細(xì)胞的自噬過程。LC3有Ⅰ型和Ⅱ型之分，當(dāng)自噬尚未發(fā)生時，LC3以可溶性的LC3-Ⅰ存在，當(dāng)自噬發(fā)生時，LC3與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，轉(zhuǎn)化成脂溶性的LC3-Ⅱ〔7〕。LC3-Ⅱ的含量多少與自噬泡的數(shù)量成正比，因此LC3-Ⅱ的表達(dá)強度與自噬活性密切相關(guān)，是自噬檢測的標(biāo)記〔8〕。LC3-Ⅱ與多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，在AD轉(zhuǎn)基因鼠及β-淀粉樣蛋白作用的原代皮質(zhì)神經(jīng)元中LC3-Ⅱ表達(dá)上調(diào)。而亨廷頓蛋白的突變導(dǎo)致了骨骼肌中LC3-Ⅱ的合成增加〔9〕。Morimoto等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，在ALS發(fā)病期，LC3-Ⅱ在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠模型脊髓中是上調(diào)的，表明LC3-Ⅱ誘導(dǎo)的自噬激活可能參與了ALS發(fā)病。我們的實驗結(jié)果顯示，在ALS發(fā)病期，海馬組織中LC3-Ⅱ在mRNA及蛋白水平均明顯上調(diào)，由此提示，ALS海馬組織的病變與自噬異常有關(guān)。最近，一個大規(guī)模的蛋白質(zhì)組學(xué)實驗揭示在人自噬過程中，LC3-Ⅱ和它的直系同源物組成了約67種蛋白的網(wǎng)絡(luò)〔10〕。而LC3-Ⅱ調(diào)控自噬途徑的機(jī)制可能與蛋白質(zhì)之間的相互作用有關(guān)。Atg4是一種半胱氨酸蛋白激酶，能夠可逆性的催化LC3形成脂質(zhì)化及去脂質(zhì)化LC3。在哺乳動物中，有四種Atg4的同系物，包括Atg4A、Atg4B、Atg4C及 autophagin-4，其中Atg4B對LC3-Ⅱ有明顯的特異性及高效性。研究發(fā)現(xiàn)，非活化Atg4B的高表達(dá)可以通過抑制LC3-I的脂質(zhì)化而明顯抑制自噬體的形成〔11〕，由此提示，Atg4B和LC3通過之間的相互作用參與了細(xì)胞的自噬過程。目前，在ALS發(fā)病中Atg4B和LC3-Ⅱ是否參與了海馬組織病變尚未見報道。我們的研究結(jié)果顯示，Atg4B和LC3-Ⅱ均主要在海馬組織的DG區(qū)表達(dá)，但是表達(dá)趨勢相反，在ALS發(fā)病期，海馬組織中Atg4B的表達(dá)下調(diào)，而LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯上調(diào)，提示Atg4B和LC3-Ⅱ在ALS發(fā)病期海馬組織的病變中發(fā)揮了作用，而且兩者之間還可能通過一定的調(diào)控機(jī)制共同參與其中。同時，我們還發(fā)現(xiàn)，在ALS轉(zhuǎn)基因鼠的海馬組織中，自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ在蛋白水平明顯上調(diào)，但是在mRNA水平變化并不明顯，因此，LC3-Ⅱ在蛋白水平的表達(dá)可能存在更復(fù)雜的分子機(jī)制。這些分子機(jī)制有待于我們進(jìn)一步研究和探討。

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〔2014-09-19修回〕

(編輯 郭 菁)

國家自然科學(xué)基金青年基金(81401066)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2012HQ021)；山東省教育廳課題(J11LF16，J12LK51，J13LK05)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2013W-S0279)；濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃項目(201302089，2013-01074)

陳燕春(1979-)，女，副教授，博士，主要從事神經(jīng)發(fā)育與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)研究。

周風(fēng)華(1977-)，女，副教授，碩士，主要從事神經(jīng)病理研究。

R744.8

A

1005-9202(2015)12-3216-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.013

1 濰坊醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院 2 濰坊醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室