畢 勝 劉 群 范 佳 李 冬 王李鳴 趙巖巖 關(guān)雪蓮 侯麗淳 田嘉瑩 王增冕 李曉濤 李培育

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

腦出血患者血腫周圍組織T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3的表達(dá)及意義

畢 勝 劉 群1范 佳2李 冬 王李鳴 趙巖巖 關(guān)雪蓮 侯麗淳 田嘉瑩 王增冕 李曉濤 李培育

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的 觀察腦出血血腫周圍組織T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3的表達(dá)，并探討其在腦出血發(fā)病中的意義。方法 行血腫清除術(shù)的腦出血患者48例按發(fā)病距手術(shù)取材時(shí)間分為≤6 h組、6～24 h組、24～72 h組和>72 h組，每組12例。另選取遠(yuǎn)離血腫的腦組織12例作為對(duì)照組。免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)TIM-3蛋白的表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)TIM-3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，≤6 h組血腫周圍組織中TIM-3的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，其他各實(shí)驗(yàn)組血腫周圍組織中TIM-3的表達(dá)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。24～72 h組血腫周圍組織中TIM-3的表達(dá)顯著高于其他各實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。RT-PCR 法檢測(cè)血腫周圍組織TIM-3的表達(dá)表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。結(jié)論 腦出血血腫周圍腦組織TIM-3 的表達(dá)在發(fā)病6 h后增高，24～72 h達(dá)最高，72 h后降低。TIM-3參與腦出血后的病理過程，可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。

腦出血;T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3

多種機(jī)制參與腦出血后的炎癥反應(yīng)及組織損傷。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3與多種炎癥性疾病的發(fā)病有關(guān)，本文擬研究腦出血血腫周圍組織TIM-3的表達(dá)及其意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 2013年1月至2014年12月我院神經(jīng)外科收治的腦出血行血腫清除術(shù)患者48例。按發(fā)病距手術(shù)取血腫旁1 cm左右腦組織時(shí)間分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)4組，分別為≤6 h組、>6 h且≤24 h 組、>24 h且≤72 h 組和>72 h 組，每組12例。另選取遠(yuǎn)離血腫的腦組織6例作為對(duì)照組。均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)〔1〕。

1.2 主要試劑 RT-PCR 試劑盒，湖南晶科生物科技有限公司；PCR 引物，上海生工生物工程有限公司；Trizol，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司； SP 試劑盒，北京北瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司；DAB 顯色劑，上海寶曼生物科技有限公司；山羊抗兔 HRP 標(biāo)記的二抗，上海研卉生物科技有限公司；兔抗人TIM-3 多克隆抗體，上海領(lǐng)成生物科技有限公司。

1.3 取材 將每塊腦組織分兩份，一份以液氮凍存，一份以10%甲醛固定液中固定，石蠟包埋。

1.4 TIM-3蛋白和mRNA測(cè)定 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)TIM-3蛋白表達(dá)。光鏡學(xué)檢查，細(xì)胞形態(tài)完整，胞質(zhì)中棕黃色顆粒狀物質(zhì)為 TIM-3 陽性細(xì)胞。在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取20個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，取其平均值為該樣本的陽性細(xì)胞數(shù)。RT-PCR法檢測(cè)TIM-3 mRNA 的表達(dá)。PCR引物設(shè)計(jì)：內(nèi)參基因β-actin(299 bp)的引物序列為：上游5'-CCTGGACTTCGAGCAAGA-3'，下游5'-GGGCAGTGATCTCCTTCT- 3'，目的基因TIM-3(558 bp)的引物序列為：上游5'-CCAAATCCCAGGCATAAT-3'，下游5'-AAGCGACAACCCAAAGGT-3'。采用Trizol法提取腦組織中的總 RNA。將 RNA 溶解在10 μl DEPC處理過的水中。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過PCR將DNA片段擴(kuò)增，總共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物跑1.5%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，20 min)，凝膠成像系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組TIM-3 的表達(dá) ≤6 h組血腫周圍組織中TIM-3的表達(dá)與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其他各實(shí)驗(yàn)組TIM-3的表達(dá)與對(duì)照組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。>24 h且≤72 h組血腫周圍組織中TIM-3的表達(dá)顯著高于其他各實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組TIM-3表達(dá)(×400)

2.2 各組TIM-3 mRNA的表達(dá) ≤6 h組血腫周圍組織中TIM-3 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其他各實(shí)驗(yàn)組TIM-3 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。>24 h且≤72 h組血腫周圍組織中TIM-3 mRNA的表達(dá)顯著高于其他各實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組TIM-3 mRNA表達(dá)

3 討 論

腦出血后血腫對(duì)周圍組織產(chǎn)生明顯的壓迫，血腫周圍組織隨之發(fā)生一系列變化，凝血酶釋放〔2〕，炎性細(xì)胞浸潤〔3〕，補(bǔ)體系統(tǒng)的激活〔4〕，炎癥介質(zhì)的釋放〔5〕，細(xì)胞凋亡〔6〕等機(jī)制均參與腦出血后的病理過程。最近的研究〔7〕表明，TIM-3在天然免疫及獲得性免疫均具有重要作用。它不僅表達(dá)于Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞表面，也表達(dá)于單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹突細(xì)胞等多種細(xì)胞表面。TIM-3與其相應(yīng)的配體半乳凝素-9結(jié)合，能負(fù)性調(diào)節(jié)Th1及Th17細(xì)胞，減弱其應(yīng)答，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

已有研究證實(shí)，在腦出血發(fā)病6 h后血腫周圍組織中干擾素(IFN)-γ、IL-17的表達(dá)增加，提示腦出血發(fā)病6 h后Th1及Th17細(xì)胞均被動(dòng)員，分泌細(xì)胞因子，參與腦出血后的病理過程〔8〕。本研究提示TIM-3參與腦出血的病理過程，有效地調(diào)控TIM-3的表達(dá)，可能有效地控制腦出血后的組織損傷。IFN-γ、IL-17的來源可能是除T細(xì)胞外的其他細(xì)胞。TIM-3也可能表達(dá)于膠質(zhì)細(xì)胞等多種除T細(xì)胞外的其他細(xì)胞，其來源仍需進(jìn)一步研究。

1 王新德. 各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)〔J〕.中華神經(jīng)科雜志，1996;29(6):379.

2 史 帝，崔桂云.凝血酶在腦出血中作用機(jī)制的研究〔J〕. 中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2014;17(10):138-40.

3 潘新發(fā). 腦出血后血腫周圍組織炎癥反應(yīng)的研究進(jìn)展〔J〕. 國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2010;37(3):263-7.

4 石明超，李玉玲，吳 江.補(bǔ)體激活與腦出血后繼發(fā)腦損傷〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2010;27(6):568-70.

5 李 萍，趙樹明，胡亞男，等. 腦出血發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕. 中華老年心腦血管病雜志，2015;17(2):214-5.

6 陳美錟，張 鴻.腦出血與炎癥反應(yīng)研究進(jìn)展〔J〕. 遼寧醫(yī)學(xué)雜志，2014;28(2):88-9.

7 Han G，Chen G，Shen B，etal. Tim-3:an activation marker and activation limiter of innate immune cells〔J〕.Front Immunol，2013;10(4):449.

8 畢 勝.Th17細(xì)胞在人腦出血中的作用及機(jī)制研究〔D〕.長春：吉林大學(xué)，2012.

〔2014-12-19修回〕

(編輯 苑云杰)

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H201359);黑龍江省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(2013235)；佳木斯大學(xué)校級(jí)青年基金項(xiàng)目(Sq 2013-022)

李培育(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腦血管病的發(fā)病機(jī)制研究。

畢 勝(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事腦血管病的發(fā)病機(jī)制研究。

R743.34

A

1005-9202(2015)12-3201-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.007

1 吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 2 吉林大學(xué)白求恩第二醫(yī)院