侯雪芹 張 磊 林雅萍 田會娟 張春霞 劉 玉 楊 從 王 奇 陳云波 程淑意 方淑環(huán)

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405)

·基礎(chǔ)研究·

4種阿爾茨海默病動物模型行為學(xué)改變及凋亡機(jī)制的比較

侯雪芹 張 磊 林雅萍 田會娟 張春霞 劉 玉 楊 從 王 奇 陳云波 程淑意 方淑環(huán)

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405)

目的 探討4種常見阿爾茨海默病(AD)動物模型在研究凋亡機(jī)制領(lǐng)域中的優(yōu)勢。方法 采用4種常見AD模型(東莨菪堿致記憶障礙模型、鵝膏蕈酸致癡呆大鼠模型、快速老化模型、雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型)，利用Morris水迷宮測試動物模型認(rèn)知能力；免疫印跡檢測Bcl-2蛋白表達(dá)水平；TUNEL染色檢測凋亡水平。結(jié)果 在凋亡機(jī)制研究探討中，快速老化小鼠(SAM)在Morris水迷宮測試、Bcl-2蛋白表達(dá)以及凋亡檢測中其正常組與模型組均有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論 SAM模型在老年癡呆凋亡機(jī)制中有明顯優(yōu)勢，為中藥治療老年癡呆的臨床前研究提供指導(dǎo)。

老年癡呆模型；Morris水迷宮；免疫印跡；免疫組化

阿爾茨海默病(AD)是一種與年齡相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，病因不明、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜〔1〕。大量的研究表明，在AD發(fā)病過程中，細(xì)胞凋亡起主導(dǎo)作用，由于細(xì)胞凋亡的機(jī)制涉及一系列基因的復(fù)雜調(diào)控，因此在不同的細(xì)胞，凋亡調(diào)節(jié)也存在差異〔2，3〕。Bcl-2通過抑制多種形式的細(xì)胞凋亡延長細(xì)胞生命，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目增加。本研究通過檢測4種常見AD動物模型的學(xué)習(xí)記憶能力及Bcl-2蛋白表達(dá)水平，比較凋亡機(jī)制研究中的優(yōu)勢與不足，篩選出最佳的研究凋亡機(jī)制的AD模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 昆明種小鼠，5月齡SPF級，雄性，體重(25±2)g，來源于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(蘇)2011-0029。 5月齡SPF級SD大鼠，雌性，平均體重200～250 g，來源于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物質(zhì)量合格證號：0080828?？焖倮匣∈?SAM)P8，5月齡SPF級，雄性，體重(25±5)g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供，許可證號：SCXK(京)2006-0008，動物質(zhì)量合格證號：0201360。APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠，5月齡，SPF級，全雄性，體重(30±5)g，由南京大學(xué)模式動物研究所提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(蘇)2010-0001，動物質(zhì)量合格證號：2010625。

以上動物均飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)(三元里)校區(qū)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物房，單籠飼養(yǎng)，自由飲食自然照明。

1.1.2 試劑 氫溴酸東莨菪堿注射液，批號H44020567；鵝膏蕈酸(IBO)，Sigma，批號：28K38091V；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，碧云天生物公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒，碧波生物科技有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜，廣州生物友田科技公司提供。Trisbase、過硫酸胺(APS)、甘氨酸均為Bio-rad產(chǎn)品；原位末端標(biāo)記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒為Roche產(chǎn)品。

1.1.3 儀器 TECAN多功能自動酶標(biāo)儀；超低溫冰箱：Forma Scientific；高速離心機(jī)：貝克曼Microfuge Lite；脫水機(jī)：LEICA TP1020；包埋機(jī)：LEICA EG1160；切片機(jī)：LEICA RM2135；圖像采集與分析儀：LEICA DM4000B顯微鏡與LEICA QWIN plus軟件。微量進(jìn)樣器，上海安亭微量進(jìn)樣器廠生產(chǎn)，規(guī)格為1 μl；大鼠腦立體定位儀，深圳瑞沃德生命科技公司生產(chǎn)，型號：MP8002，SN：06091714；Morris水迷宮及軟件由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供，型號DMS-2。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 鹽酸多奈哌齊片(治療組藥物)，使用前將片劑研成粉末，以蒸餾水配制成灌胃藥液，配制濃度為0.4 mg/ml。IBO以超純水稀釋，配制成5 μg/μl的IBO注射液。

1.2.2 模型制備

1.2.2.1 東莨菪堿致記憶障礙模型小鼠 參照葉翠飛等〔4〕方法，于每天試驗(yàn)前(各組腹腔注射給藥30 min后)除正常組腹腔注射等量的生理鹽水外，其余各組小鼠均腹腔注射東莨菪堿1 mg/kg，直到實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束。

1.2.2.2 IBO致癡呆大鼠模型 大鼠腦立體定位參照包新民等〔5〕方法，先將大鼠用10%水合氯醛0.35 ml/100 g的劑量腹腔注射麻醉，將其固定在腦立體定位儀上，常規(guī)消毒大鼠頭部皮膚，在頭部中線處，縱開1.0～2.0 cm左右切口。用10%雙氧水擦拭，直到暴露大鼠前囟點(diǎn)(雙氧水一則使前囟骨縫顯露更清晰，二則消毒，避免厭氧菌感染)。將微量進(jìn)樣器的針頭對準(zhǔn)前囟，抽取1 μl IBO(假手術(shù)組以生理鹽水代替)，拔出三棱針，將標(biāo)尺移回原來所定的點(diǎn)上，向硬膜下移動8.2 mm。單側(cè)注射IBO 5 μg，在10 min內(nèi)注完，盡量保持勻速，留針5 min。留針完后出針，同樣方法對側(cè)相同位置注射IBO 5 μg。兩側(cè)注藥完畢后，將大鼠從定位儀上取下來，縫合大鼠頭皮，最后用酒精常規(guī)消毒傷口。

1.2.3 動物分組和給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為正常組、模型組、鹽酸多奈哌齊(陽性藥)組，因造?；蚱渌蛩?如灌胃)、死亡等導(dǎo)致每組種子數(shù)有所差異，但每組不少于8只。

1.2.4 學(xué)習(xí)記憶能力測試 使用Morris水迷宮測試軟件，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供。水迷宮由圓形水池、無色平臺和記錄系統(tǒng)3部分組成。水池直徑100 cm，高50 cm，水池內(nèi)壁涂成黑色，以通過池圓心的兩條垂直交叉線將水池分為西北、東北、東南、西南4個(gè)象限，分別定為1、2、3、4象限。平臺置于第4象限，直徑7 cm，高29 cm，平臺邊緣有孔洞以便于小鼠抓牢。水迷宮檢測軟件系統(tǒng)自動跟蹤池內(nèi)小鼠的活動軌跡并記錄游泳時(shí)間、路程、在各象限停留時(shí)間和跨平臺次數(shù)等項(xiàng)參數(shù)。

1.2.5 Western印跡檢測蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)鼠行為學(xué)測試后快速斷頭處死，迅速冰上剝離大腦新鮮組織標(biāo)本，分別置于EP管中，-80℃儲存?zhèn)溆?。將每只?shí)驗(yàn)鼠的大腦組織用1 ml放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)組織/細(xì)胞裂解液、10 μl的苯甲磺酰氟(PMSF)和100 μl磷酸酶抑制劑在冰上進(jìn)行超聲粉碎、勻漿，然后于4℃，15 000 r/min離心30 min，取上清液，用BCA方法測定其蛋白質(zhì)的濃度。實(shí)驗(yàn)步驟主要參照馬文麗〔6〕方法進(jìn)行。應(yīng)用生物凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gene Genius Bioimage analysis system)掃描，采用GeneSnap軟件拍攝圖片，GeneTool軟件進(jìn)行條帶的灰度值定量分析。用β-actin作為參照，比較各組樣品目的蛋白/內(nèi)參照蛋白β-actin比值變化。

1.2.6 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 將大腦組織4%多聚甲醛固定，24 h后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片，用TUNEL檢測細(xì)胞凋亡。 每張切片選取同一部位先于10×10倍鏡下觀察TUNEL染色情況，再于40×10倍鏡下分別選取3個(gè)不重復(fù)的視野，使用LEICA QWIN plus圖像分析軟件采集圖像，所有圖像采集時(shí)曝光時(shí)間及色彩飽和度等參數(shù)一致，采用LEICA QWIN plus圖像分析軟件檢測陽性染色，以同一顏色檢測標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算陽性染色區(qū)域面積及陽性染色面積占圖像面積的百分比。以3個(gè)視野的平均值代表該張切片的凋亡水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行重復(fù)測量方差分析或單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮成績 4種AD動物模型定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期的組間比較結(jié)果見表1。

2.2 抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平 對于東莨菪堿致記憶障礙模型，模型組較正常組Bcl-2表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，陽性藥組較模型組Bcl-2表達(dá)水平升高(P<0.05)。對于IBO致癡呆大鼠模型，模型組較正常組Bcl-2表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，陽性藥組較模型組Bcl-2表達(dá)水平升高(P<0.05)。 對于SAMP8，模型組較正常組Bcl-2表達(dá)水平低(P<0.05)，陽性藥組Bcl-2表達(dá)水平高于模型組(P<0.05)。對于雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，模型組較正常組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)，陽性藥組Bcl-2表達(dá)水平有高于模型組的趨勢。見表2，圖2。

2.3 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 4種AD動物模型腦組織切片TUNEL染色結(jié)果見表3。

表1 4種AD動物模型定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期的組間比較±s,s,n=4)

與正常組(假手術(shù)組)比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，下表同

表2 4種AD動物模型腦組織Bcl-2表達(dá)水平

表3 4種AD動物模型腦組織細(xì)胞凋亡百分率

A～D分別表示東莨菪堿模型小鼠、IBO致癡呆大鼠、SAMP8和APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠；1～3分別表示正常組(假手術(shù)組)、模型組、陽性藥組

3 討 論

本文4種模型主要依據(jù)AD病因病理研究而成，各有其特點(diǎn)，都在一定的程度上或某些方面模擬了 AD的癥狀和病理改變，各自具有自己的適用范圍和作用，又各有優(yōu)勢與不足〔7〕。

IBO及東莨菪堿誘導(dǎo)模型雖表現(xiàn)有膽堿能系統(tǒng)功能喪失和學(xué)習(xí)記憶損害，但無全身衰老的表現(xiàn)〔8〕。轉(zhuǎn)基因模型僅出現(xiàn)淀粉樣蛋白沉積，影響因素較多〔9〕。目前AD研究的重點(diǎn)已從損毀模型轉(zhuǎn)移到了自身免疫模型和轉(zhuǎn)基因模型，建立自身免疫模型和轉(zhuǎn)基因模型(包括基因剔除模型)對研究AD的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，但目前仍面臨許多問題有待解決。SAM P8是一個(gè)較好的AD替代模型，它既有學(xué)習(xí)記憶功能障礙等衰老的特征，又有明顯的細(xì)胞凋亡跡象。SAP8是公認(rèn)的研究老年癡呆的動物模型，其學(xué)習(xí)記憶障礙出現(xiàn)較早且自然發(fā)生，具有老年癡呆的病理學(xué)特征，能很好地模擬AD的學(xué)習(xí)記憶障礙形成過程。目前已被應(yīng)用于衰老及AD防治藥物實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)研究，能夠較好地再現(xiàn)淀粉樣蛋白沉積、老年斑及免疫功能紊亂等AD的一些重要特征，具有較大的實(shí)用價(jià)值。APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠是由APPswe 轉(zhuǎn)基因小鼠和PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交所得，表型穩(wěn)定，APP 基因PCR 產(chǎn)物長344 kb ，PS 基因PCR 產(chǎn)物長608 kb。因此，在研究治療老年性癡呆的藥物時(shí)，應(yīng)依據(jù)研究機(jī)制選擇不同動物品系、為AD治療藥物的研究開發(fā)及作用機(jī)制探討提供可行的依據(jù)，做到全面、系統(tǒng)、合理、科學(xué)評價(jià)藥物的療效與作用機(jī)制，更好地為臨床服務(wù)。

1 于天蓮,趙小貞. 阿爾茨海默病動物模型研究概況〔J〕. 醫(yī)學(xué)綜述,2009;15(18):2726-9.

2 蔡琳琳. 中藥復(fù)方有效組分早期干預(yù)對APP轉(zhuǎn)基因小鼠膽堿能系統(tǒng)及腦細(xì)胞凋亡的影響〔D〕.北京：中國中醫(yī)科學(xué)院碩士論文,2010.

3 Pelkey TJ,Frierson HF,Bruns DE. Molecular and immunological detection of circulating tumor cells and micrometastasis from solid tumor〔J〕. Clin Chem，1996;42(9):1369-81.

4 葉翠飛,張 蘭,張 麗,等.?；撬釋|莨菪堿所致記憶獲得性障礙模型小鼠的改善作用〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào),2005;21(6):715-7.

5 包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社,1991.

6 馬文麗. 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊〔M〕.北京：人民軍醫(yī)出版社,2011:11.

7 趙保勝,徐暾海. 老年性癡呆疾病模型的建立〔J〕. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011;17(6):274-6.

8 謝 寧,宋琳莉,牛英才,等. 老年性癡呆動物模型研究進(jìn)展及其評價(jià)〔J〕.實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué),2006;26(1):50-3.

9 魏小龍,張永祥. 老年性癡呆動物模型研究進(jìn)展〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào),2000;16(4):372-6.

〔2013-12-23修回〕

(編輯 袁左鳴)

Comparation of behavioristics and mechanism of apoptosis in four kinds of AD animal models

HOU Xue-Qin,ZHANG Lei,LIN Ya-Ping,etal.

Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,Guangdong,China

Objective To discuss advantages of 4 common AD animal models on research mechanism of apoptosis.Methods Four common AD model-scopolamine dysmnesia model,ibotenic acid dementia model,senescence accelerated model and double transgenic mice model were used. The cognitive competences of animal models were evaluated by Morris water maze. Bcl-12 protein expression was tested by Western blot and apoptosis was measured by immunohistochemistry TUNEL staining.Results The results of Morris water maze test,Bcl-12 protein expression and apoptosis had significant differences of SAM between normal and model groups(P<0.05).Conclusions SAM model has its great advantage in mechanism of apoptosis of AD,so it could offer guidance in preclinical study of treating-AD herbs.

AD animal model;Morris water maze;Western blot;Immunohistochemistry

國家自然科學(xué)基金(No.81273817)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(No.201144251100a07)；廣東省重大科技專項(xiàng)(No.2012A080202017)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2010A030100009)；廣東省高等學(xué)校科技創(chuàng)新項(xiàng)目(No.2012KJCX0032)

王 奇(1963-)，男，教授，主要從事腦病臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

侯雪芹(1985-)，女，博士，主要從事腦病臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

R259

A

1005-9202(2015)12-3185-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.001