廖 鑫，張安星，高 琳，張 晗，陽 琰

(貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴州 遵義 563000)

技術(shù)與方法

二甲雙胍對糖尿病非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟內(nèi)臟脂肪素表達的作用

廖 鑫1，張安星1，高 琳1，張 晗1，陽 琰1

(貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴州 遵義 563000)

目的 觀察二甲雙胍對糖尿病合并非酒精性脂肪肝病大鼠肝臟內(nèi)臟脂肪素表達的影響。方法 雄性SD大鼠，分為正常對照(NC)組，肥胖組(OB組)，糖尿病(DM)組和二甲雙胍(MET)組。所有大鼠均測FBG、TG、TC、HDL-C、LCL-C、FFA、FIns，計算HOMA-IR指數(shù)。采用RT-PCR測定肝臟內(nèi)脂素 mRNA表達，Western blotting測定蛋白表達,H.E.染色后觀察肝臟病理變化。結(jié)果 OB組及DM組FBG、TG、TC、HDL-C 、LCL-C、FFA、FIns、HOMA-IR均增高(P<0.05)，ISI顯著減低(P<0.01)，肝臟發(fā)生脂肪變性。MET組上述指標(biāo)均顯著下降。DM組大鼠肝臟內(nèi)脂素mRNA及蛋白表達較NC組及OB組均顯著增高(P<0.05)，MET組較糖尿病組顯著降低(P<0.01),肝臟脂肪變性程度減輕。結(jié)論 二甲雙胍能減輕糖尿病大鼠肝臟脂肪變性，可能與降低了肝臟visfatin的表達有關(guān)。

二甲雙胍;糖尿病;非酒精性脂肪性肝病;大鼠;內(nèi)臟脂肪素

眾多資料顯示，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的形成由多個因素參與,如胰島素抵抗(insulin resist IR)、脂代謝異常、氧化應(yīng)激，以及脂肪因子的作用等[1]。內(nèi)臟脂肪素(visfatin)是目前研究較多的臟脂肪因子，其與IR密切相關(guān)。本研究測定了糖尿病(DM)合并NAFLD大鼠肝臟內(nèi)脂visfatin mRNA的表達，并用二甲雙胍干預(yù)后觀察大鼠肝臟的病理變化，從而探討二甲雙胍對DM合并NAFLD大鼠visfatin mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器與試劑

雄性SD大鼠(SPF級)，體重185-220g，大鼠及喂養(yǎng)飼料均購買于第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院動物實驗中心。老鼠房間室溫保持于20-26 ℃之間，12小時光照，自由飲水。胰島素放免試劑盒(美國LINCO公司)，鏈脲佐菌素(STZ)(美國sigma公司)；Visfatin抗體(美國Biovision公司)，Trizol Reagent、焦碳酸二乙酯、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR? GREEN PCRMaster Mix(大連寶生物公司)。visfatin及β-actin引物的設(shè)計、合成(大連寶生物公司)。β-actin抗體(北京中杉金橋公司)。RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度定量試劑盒、彩色預(yù)染marker及ECL顯色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。鹽酸二甲雙胍(施貴寶制藥公司)。

1.2 模型的建立 雄性SD大鼠60，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機分為正常對照組(NC組)10只，普通飼料喂養(yǎng)；肥胖組(DIO組)，高糖高脂飼料喂養(yǎng)，以體重>A組平均體重的20%為肥胖組大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)，10只成模。糖尿病模型組(DM組)，高糖高脂飼料喂養(yǎng)，給予腹腔注射鏈脲佐菌素(40 mg/kg)，以2次血糖≥16.7 mmol/L，做為糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)，共成模20只。糖尿病成模后，其中10只作為糖尿病組，另10只用鹽酸二甲雙胍100 mg/kg.d灌胃，作為二甲雙胍組(MET)，將空腹血糖控制<11.1 mmol/L，共成模9只。

1.3 標(biāo)本的采集

1.3.1 12周后各組大鼠禁食稱重，10%水合氯醛麻醉，取血離心后留取血清，用于測定TC、TG、LDL-C、FFA、FIns。迅速取出肝臟，用濾紙吸干水分，稱重。將肝臟置于1 mL Trizol中，-80 ℃冰箱凍存，用于visfatin mRNA及蛋白的測定。

1.3.2 RT-PCR法測定肝臟visfatin mRNA的表達：按照氯仿-異丙醇-乙醇法提取肝臟總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再予RT-PCR測定visfatin mRNA的表達，使用美國BIO-RAD公司icycler 熒光定量PCR進行檢測。

1.3.3 Western blot 法測定肝臟蛋白的表達：將凍存肝臟組織取出，使用預(yù)冷PBS洗滌后剪碎，加入RIPA強效裂解液，冰上超聲震碎，裂解，4 ℃離心30 min后取上清。按BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性(100 ℃,5 min)后上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入visfatin一抗孵育過夜。第二日洗膜后加入二抗搖床中孵育1 h，ECL顯影成像。

1.4 肝臟病理學(xué)觀察 取出小塊肝組織，流水洗凈，石蠟包埋，行H,E.染色，并在光鏡下觀察肝臟組織形態(tài)，病理診斷依據(jù)非酒精性脂肪肝病診療指南[2]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計分析,(±S)表示。多組間比較采用方差分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 與NC組相比，DIO組及DM組FBG、TG、TC、LDL-C、FFA、FIns、HOMA-IR均增高(P<0.05)，ISI顯著減低(P<0.01)。與DIO組大鼠相比，DM組FBG、TG、TC、LDL-C、FFA、FIns、HOMA-IR也顯著增高，ISI顯著降低(P<0.01)。MET組上述指標(biāo)顯著下降(見表1)。

表1

GroupNC組(n=10)DIO組(n=10)DM組(n=10)MET組(n=9)體重(g)412．60±41．24621．90±30．12△403．78±45．52●422．67±29．27●◇內(nèi)臟脂肪重量(g)8．46±2．2926．59±6．70△8．59±3．78●11．22±5．44●◇內(nèi)脂重/體重(%)2．07±0．524．29±1．04△2．03±0．81●2．62±1．23●◇空腹血糖(mmol/L)4．32±1．025．21±0．4321．43±2．67△●6．97±1．35★總膽固醇(mmol/L)1．11±0．321．59±0．416．71±3．27?1．80±0．33△低密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)0．37±0．130．44±0．223．66±1．57?#0．47±0．19☆游離脂肪酸(mmol/L)368．50±135．73480．45±147．511301．30±453．58△#646．56±192．97?空腹胰島素(uIU/L)10．40±3．2524．45±8．77△38．18±9．11△●-HOMA-IR2．01±0．755．61±2．24△43．21±10．71△●-ISI0．03±0．010．01±0．005△0．001±0．0001△●-

HOMA-IR:穩(wěn)態(tài)模型評估法-胰島素抵抗指數(shù)；ISI:胰島素敏感指數(shù)； 與NC組比較 ,*P<0.05, △P<0.01;與DIO組比較,#P<0.05,●P<0.01;vs. 與 DM組比較, ☆P<0.05,★P<0.01。

2.2 DM組大鼠肝組織visfatin mRNA、蛋白表達較NC組、DIO組顯著增高(P<0.05)，MET組較DM組顯著降低(P<0.01,表2、圖1)。

表2 各組間肝臟visfatin mRNA及visfatin蛋白表達

GroupVisfatinmRNAVisfatinNC組(n=4)65．41±28．730．39±0．18DIO組(n=4)116．23±57．660．60±0．22DM組(n=4)220．03±96．62△#0．75±0．23△M+DM組(n=4)36．05±16．51★0．66±0．14?

與NC組比較,*P<0.05,△P<0.01;與DIO組比較，#P<0.05,●P<0.01; 與DM組比較,☆P<0.05,★P<0.01。

圖1 大鼠肝臟visfatin的蛋白表達(western bolt)

2.3 各組間肝臟病理學(xué)變化 NC組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞質(zhì)無脂滴，細(xì)胞核處于中心，大而圓；DIO組肝細(xì)胞腫脹明顯，部分可見脂肪變性,肝小葉形態(tài)完整,無明顯炎性細(xì)胞浸潤；DM組肝細(xì)胞彌漫性腫脹，廣泛肝細(xì)胞脂肪變性,可見大量脂肪空泡及匯管區(qū)慢性炎細(xì)胞浸潤，纖維組織增生。MET組肝細(xì)胞輕度腫脹，部分脂肪變性及脂肪空泡。(圖2)

A:NC組;B:OB組;C:DM組;D:MET組。

3 討論

NAFLD是近年來較常見的肝臟疾病，主要以肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征，它的病理學(xué)改變與酒精性脂肪肝相似，但這類患者通常無長期大量飲酒史，而與肥胖、高血糖、高血脂、高胰島素等代謝紊亂疾病相關(guān)。在2型糖尿病(T2DM)及高脂血癥患者中，NAFLD的患病率分別是28%-55%，27%-92%。所以，隨著DM等疾病的發(fā)病率增長，NAFLD的患病率也逐漸上升[3-4]。DM(特別是T2DM)及NAFLD均是由于體內(nèi)糖脂代謝紊亂所致，目前認(rèn)為與IR密切相關(guān)，相關(guān)研究已證實IR不僅能引起骨骼肌、脂肪對葡萄糖的代謝障礙，而且還參與了NAFLD發(fā)病整個過程，此外，在骨骼肌、脂肪及肝臟發(fā)生的IR與NAFLD具有直接的相關(guān)性[5-6]。而在NAFLD患者中，T2DM及糖尿病前期的風(fēng)險亦相對較大，NAFLD是能預(yù)測糖尿病發(fā)生的一個因素[7]。本研究中的相關(guān)結(jié)果顯示，DM組血脂譜、FIns、HOMA-IR顯著增高，ISI顯著降低，且病理學(xué)變化也顯示，DM組大鼠肝臟發(fā)生了明顯的脂肪變性，符合NAFLD的相關(guān)肝臟病理改變，同時也證明了DM、NAFLD與IR密切相關(guān)。

DM及NAFLD之間關(guān)系密切，相互影響，均與高血糖、高血脂密切相關(guān)，且兩者均存在腹型肥胖，會導(dǎo)致大量的內(nèi)臟脂肪聚集。visfatin已被證實是一種在內(nèi)臟脂肪中大量表達的脂肪因子，故在DM合并NAFLD體內(nèi)，可能會出現(xiàn)visfatin的高表達。多數(shù)研究認(rèn)為visfatin能調(diào)節(jié)胰島素的分泌、使胰島素受體的磷酸化，從而發(fā)揮類似胰島素的作用，這是通過β細(xì)胞功能相關(guān)的基因表達來實現(xiàn)的。且有研究發(fā)現(xiàn)，visfatin在肥胖者的大網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞中的表達高于皮下脂肪[8]，表明其參與了內(nèi)臟脂肪的合成。本實驗中，DIO組及DM合并NAFLD大鼠肝組織visfatin mRNA及蛋白表達水平顯著增高，內(nèi)臟脂肪組織聚集可能導(dǎo)致visfatin的表達上升，由于DM合并NAFLD大鼠存在明顯的IR，這些都提示visfatin與IR相關(guān)。而肝臟visfatin的表達增加可能也促進了脂肪的形成，并參與了大鼠脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展。

二甲雙胍是傳統(tǒng)的經(jīng)典降糖藥物，它能促進胰島素與受體的結(jié)合，并通過降低肝糖原的異生、抑制肝糖原輸出，增加骨骼、肌肉等胰島素靶器官對葡萄糖的攝取和利用，發(fā)揮降糖作用。在其降糖作用中，一個重要的途徑是AMPK通道的激活，有研究表明，AMPK能夠直接參與機體葡萄糖的調(diào)節(jié)[9]。AMPK由α亞基、β亞基及γ亞基所組成，α亞基在骨骼肌、肝臟等高表達，一旦α亞基上的蘇氨酸殘基被磷酸化，其即被活化并激活A(yù)MPK通道[10]。而其活性的降低，能使糖酵解減少和脂肪酸氧化，引起膽固醇、脂肪酸、蛋白質(zhì)的合成，并增加糖異生。二甲雙胍可以通過激活骨骼肌、肝臟等組織的AMPK，使AMPK活化，從而實現(xiàn)降糖作用。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種脂肪因子能夠通過調(diào)節(jié)AMPK而發(fā)揮不同作用，有研究[11]發(fā)現(xiàn)肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織visfatin蛋白的表達與AMPK的活化程度負(fù)相關(guān)，認(rèn)為visfatin可能是下調(diào)AMPK活性的重要因子，這可能與二甲雙胍的降糖機制有一定關(guān)聯(lián)。近來有研究表明，在T2DM合并慢性牙周病患者中，visfatin的水平也是明顯增高的[12]，而經(jīng)過內(nèi)科治療3月后，visfatin水平又會顯著下降[13]。而本研究顯示，DM組大鼠的肝臟visfatin mRNA和蛋白表達與NC組及DIO組比較，呈顯著增高趨勢。我們考慮可能是由于DM大鼠血糖的升高，代償性的使肝臟visfatin表達增高，從而模擬胰島素的降血糖作用，以彌補胰島素的相對不足。從我們的實驗結(jié)果可以看出，DM合并NAFLD大鼠體內(nèi)，visfatin呈增高趨勢，而其表達也與IR相關(guān)，故可能可以認(rèn)為糖尿病合并NAFLD與visfatin的表達呈正相關(guān)，考慮均由于體內(nèi)IR所致。而MET組大鼠visfatin mRNA及蛋白表達均較DM組下降，可能是二甲雙胍通過上述機制，達到改善胰島素抵抗、治療NAFLD，從而最終下調(diào)肝臟visfatin的表達所引起，這與近來對T2DM合并慢性牙周病的研究結(jié)果有其相似之處。

本研究中，經(jīng)過二甲雙胍干預(yù)后大鼠肝臟脂肪變性減輕，與相關(guān)研究結(jié)果類似[14]。同時visfatin的mRNA和蛋白表達均較DM組相應(yīng)下降，我們推測，二甲雙胍可能有降低DM合并NAFLD大鼠visfatin的表達的作用，但具體途徑及通路如何，還有待我們的進一步研究。

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[收稿2015-02-11;修回2015-03-10]

(編輯：王福軍)

Effects of metformin on liver visfatin expression of diabetic rats with non-alcoholic fatty liver disease

LiaoXin1,ZhangAnxing1,GaoLin1,ZhangHan1,YangYan

(Department of Endocrinology, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi, Guizhou 563003, China)

Objective To observe the effects of metformin on liver visfatin expression of diabetic rats with non-alcoholic fatty liver disease. Methods Male SD rats were randomly divided into four group: normal group (NC), diet-induced obesity group (OB), diabetes mellitus group (DM) and metformin treated group (MET). FBG, TG, TC, LCL-C, FFA and FIns were detected and HOMA-IR index was calculated. Liver visfatin mRNA and protein expressions were measured by real time fluorescence quantitative PCR and western blotting assay. The changes of liver were observed by light microscopy analyzed with Hematoxylin-Eosin (H.E.) staining.Results FBG, TG, TC, LCL-C, FFA, FIns and aHOMA-IR were significantly higher (P<0.05) and ISI was significantly lower than those in NC group (P<0.01). Liver fatty degeneration in rats was observed after H.E. staining. Visfatin mRNA and protein expression of liver were significantly higher in DM group than those in NC and OB groups and lower in MET Group than those in DM group (P<0.05). Liver fatty degeneration was attenuated in MET Group compared with DM group.Conclusion Metformin could significantly relieve liver fatty degeneration and these effects might be relative to the decreased visfatin expression of diabetic rats with non-alcoholic fatty liver disease.

Metformin; diabetes; non-alcoholic fatty liver disease; rats; visfatin

貴州省科技合作項目(黔科合區(qū)域合 (2010) 7004號)；貴州省科技支撐計劃項目社會發(fā)展攻關(guān)項目(黔科合SY字合(2013) 3033號)。

高琳,E-mail:lgzymc@sina.com。

[文獻標(biāo)志碼] A [文章編號] 1000-2715(2015)02-0 -0