馮寅潔, 喬勇升, 陳偉, 馮成玉, 應鐵進

(1.江蘇省泰州市食品藥品檢驗所，江蘇 泰州 225300；2.江蘇省海安縣農業(yè)委員會，江蘇 海安 226600； 3.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院食品科學與營養(yǎng)系，杭州 310058)

馮寅潔1, 喬勇升1, 陳偉1, 馮成玉2, 應鐵進3

(1.江蘇省泰州市食品藥品檢驗所，江蘇 泰州 225300；2.江蘇省海安縣農業(yè)委員會，江蘇 海安 226600； 3.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院食品科學與營養(yǎng)系，杭州 310058)

為建立固相萃取-超高效液相色譜大體積流通池熒光法檢測植物油中苯并[a]芘(benzo [a] pyrene, BaP)的方法，對4種商業(yè)化固相萃取柱凈化油樣和富集BaP的效果進行評價，同時比較了4種超高效液相色譜柱的分離效果。結果表明：借助商業(yè)化BaP專用固相萃取柱處理樣品，洗脫液旋蒸至干后用乙腈-四氫呋喃(體積比為9∶1)溶解定容，經(jīng)過BEH Shield RP18柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)分離，流動相為乙腈-水(體積比為70∶30)，流速0.4 mL/min，BaP在0.101～10.1 μg/L范圍內有良好的線性關系(r>0.999 993)，檢出限為0.2 μg/kg；商業(yè)化固相萃取柱能較好地除去樣品中的油和吸附BaP，4種固相萃取柱的3個加標水平的回收率為91.0%～106.9%，相對標準偏差為1.4%～9.6% (n=6)；用超高效液相色譜法分析樣品，速度比高效液相色譜快3倍。與國標相比，該方法具有操作簡便、重復性好、靈敏度高、節(jié)省溶劑等優(yōu)越性，可快速、準確地對植物油中的BaP進行定性和定量檢測。

植物油； 苯并[a]芘； 固相萃取柱； 超高效液相色譜； 色譜柱

Summary Benzo [a] pyrene (BaP) is a kind of polycyclic aromatic hydrocarbon, which is recognized as one of the three major carcinogens found in foods. The source of BaP detected in vegetable oil are as follows: BaP may occur when oilseeds are dried, smoked and stir-fried; organic solvents used in the leaching process may have polycyclic aromatic hydrocarbons; oil heated over temperature or overtime in the process of production and cooking may produce BaP. The recommended national method for BaP determination in animal and vegetable fats and oils (GB/T 22509—2008) requires high experimental skills and long test time, making it difficult to guarantee the accuracy and repeatability of results. Besides, another standard on determination of BaP in foods (GB/T 5009.27—2003) is also complicated in sample pretreatment.

In this study, a method for the determination of BaP in vegetable oil by solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-fluorescence detector (SPE-UPLC-FLD) with a large volume flow cell was established. Oil samples were purified by four kinds of commercial solid phase extraction cartridges to compare extraction effects. Besides, the four types of chromatographic columns used in UPLC were tested to analyze separation effects. Samples were cleaned and enriched by commercial solid phase extraction cartridges. Then, the elution was dried by rotary evaporation and then was dissolved with acetonitrile-tetrahydrofuran (volume ratio, 9∶1) to a constant volume. Sample solution was separated by BEH Shield RP18 column (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm) with the mobile phase of acetonitrile-water (volume ratio, 70∶30) at the flow rate of 0.4 mL/min.

Results showed that under the optimized conditions, a good linear relationship (r>0.999 993) was obtained in the range of 0.101-10.1 μg/L Bap, with detection limit of 0.2 μg/kg. Recovery rates for four kinds of solid phase extraction cartridges were 91.0%-106.9% in three spike levels, and relative standard deviations (RSD) were 1.4%-9.6% (n=6). Sample analysis by UPLC was three times faster than HPLC.

In conclusion, this method has many advantages such as simple pretreatment, good repeatability, high sensitivity, less solvent and so on, thus can be applied on the rapid qualitative analysis and accurate quantitative detection of BaP in vegetable oil.

苯并[a]芘(benzo [a] pyrene, BaP)是一種多環(huán)芳烴，分子結構式如圖1所示。其溶于非極性和弱極性溶劑如苯、正己烷、甲苯等，微溶于極性溶劑如甲醇、乙醇、乙腈，是世界上公認的可在食品中產生的三大致癌物之一，可通過呼吸、接觸和攝入等方式進入人體，誘導基因突變，使細胞失去正常功能，容易導致皮膚癌、肺癌、上消化道腫瘤、動脈硬化等疾病[1]。

研究認為，BaP是由煤炭、石油、天然氣、木材等不完全燃燒產生的[2]，在工業(yè)“三廢”中普遍存在。很多日常接觸的食品中也含有BaP，如谷物等糧食制品在露天晾曬時可能受到瀝青路面等外界環(huán)境引入的BaP污染，含油較多的食品在熏制、碳烤、煎炸過程中均有可能產生BaP。植物油中含BaP的主要原因包括：油料在曬干、煙熏、炒制過程中可產生BaP；用溶劑浸出法制油時，所用溶劑中含有多環(huán)芳烴；油受熱溫度過高和時間較長時可生成BaP。GB 2762—2012規(guī)定了谷物及其制品、熏烤水產品及肉制品、油脂及其制品中BaP的限量[3]，其中，油脂及其制品BaP限量值為10 μg/kg，其余為5.0 μg/kg。

現(xiàn)有檢測BaP的方法有熒光分光光度法[4]、氣相色譜-質譜法[5]、高效液相色譜-質譜法[6]等，其中高效液相色譜-熒光法為常用檢測方法。參考GB/T 22509—2008檢測動植物油脂中BaP的方法[7]，需要先自行處理中性氧化鋁至相應活度，再填裝層析柱，對操作者的實驗技能要求較高、步驟復雜、試驗時間長、難以保證結果的準確性和重現(xiàn)性，使得BaP這種強制性檢測項目難以在廣大實驗室推廣。本試驗在前處理過程中改用商業(yè)化BaP專用固相萃取柱，省去了制備固相萃取柱的過程，整個操作過程簡單，既能保證處理效果的準確性和再現(xiàn)性，又能滿足批量同步處理的要求；同時，借助超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography, UPLC)進行分析，配套色譜柱粒徑僅為1.7 μm，比高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)常用的色譜柱粒徑(5 μm)更小、填充更緊實，具有出峰快、靈敏度高、分離度好等優(yōu)點，可從基質復雜的食品中分離出目標峰，并大大縮短樣品運行時間；熒光檢測器采用大體積流通池(13 μL)，有助于對食品中含量甚微的BaP進行更準確的定量。

圖1 苯并[a]芘結構式

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀：美國Waters公司ACQUITY超高效液相色譜儀配大體積流通池熒光檢測器；液相色譜柱：美國Waters公司BEH苯基柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)、HSS T3柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)、BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、BEH Shield RP18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)；AL 204電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；Milli-Q Advantage A10超純水機(美國Millipore公司)；IKA VORTEX 3旋渦混勻器(上海萊貝科學儀器有限公司)；R201BL旋轉蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)；A柱：CNW苯并芘專用柱(500 mg/6 mL，上海安譜科學儀器有限公司)；B柱：Cleanert BaP-3 固相萃取柱(500 mg/6 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司)；C柱：HiCapt-Benzo苯并芘專用柱(500 mg/3 mL，武漢維泰克科技有限公司)；D柱：ProElut BaP 植物油苯并芘專用固相萃取柱(22 g/60 mL，美國Dikma公司)。

大豆油(某糧油企業(yè)提供)；苯并(a)芘標準溶液(5.05 μg/mL，GBW(E)080476，甲醇介質，中國計量科學研究院提供)；乙腈，正己烷，異丙醇(色譜純，美國Dikma公司)；二氯甲烷，丙酮，四氫呋喃(分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 樣品前處理

稱取大豆油0.3 g，參考各固相萃取柱的操作方法進行凈化處理，收集洗脫液，在40 ℃水浴中旋蒸至干，立即準確加入1 mL乙腈-四氫呋喃(體積比為9∶1)溶液溶解，樣液過0.22 μm微孔濾膜，待測。

1.3 苯并(a)芘標準液配制

標準曲線：用乙腈稀釋苯并(a)芘標準溶液，配成質量濃度分別為0.101、0.505、1.01、5.05和10.1 μg/L的標準使用液系列。

固相萃取(solid phase extraction, SPE)加標溶液：用正己烷稀釋苯并(a)芘標準溶液至10.1 μg/L。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：BEH Shield RP18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈-水(體積比為70∶30)；流速：0.4 mL/min；進樣量：5 μL；熒光檢測器：λex=384 nm，λem=406 nm。

2 結果與分析

2.1 色譜柱分離效果比較

大豆油經(jīng)過A柱凈化等前處理后，分別用BEH苯基、HSS T3、BEH C18和BEH Shield RP18等4種色譜柱分離，調節(jié)流動相乙腈和水的比例，流速均設為0.4 mL/min，使BaP色譜峰與前后雜質峰分開。各色譜柱分離樣品所得色譜圖和對應流動相條件如圖2～5所示，BaP峰面積依次為141 604 μV·s、147 674 μV·s、137 480 μV·s、145 323 μV·s。與其他3種色譜柱相比，BEH苯基柱分離0.505 μg/L BaP，色譜峰不對稱且峰頂出現(xiàn)分叉，表明該柱保留效果不理想。不斷調節(jié)流動相比例，T3柱分離的BaP在色譜峰前始終有小雜峰干擾，影響了積分的準確性。

V(乙腈)∶V(水)=60∶40. V(acetonitrile)∶V(water)=60∶40。

V(乙腈)∶V(水)=70∶30. V(acetonitrile)∶V(water)=70∶30.

V(乙腈)∶V(水)=88∶12. V(acetonitrile)∶V(water)=88∶12.

V(乙腈)∶V(水)=70∶30.V(acetonitrile)∶V(water)=70∶30.

2.2 進樣重復性

選擇C18柱和RP18柱分別重復進0.505 μg/L BaP標準溶液6次。結果表明：二者的保留時間平均為2.106和3.218 min，相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)為0.1%和0.2%；峰面積的平均值分別為482 861 μV·s和300 678 μV·s，RSD為1.1%和1.3%。定性和定量的重復性均較理想。

2.3 線性關系和檢出限

從低到高依次進標準液0.101、0.505、1.01、5.05和10.1 μg/L，分別用C18柱和RP18柱分離，以BaP峰面積為縱坐標Y，質量濃度為橫坐標X，得線性回歸方程。C18柱為Y=562 000X+98 100，r=0.999 955；RP18柱為Y=576 000X+18 400，r=0.999 993。RP18柱對應的線性更好，尤其在0.101～1.01 μg/L的低質量濃度范圍內，峰面積與濃度呈良好的線性關系，說明該色譜柱更適用于微量BaP的檢測。借助RP18柱分離樣品溶液，根據(jù)3倍信噪比，得方法檢出限為0.2 μg/kg，比GB/T 22509—2008規(guī)定的最低檢出限(0.1 μg/kg)稍高。

2.4 固相萃取柱處理效果比較

稱取大豆油0.3 g，分別添加BaP溶液至2、5和10 μg/kg 3個水平，用A、B、C、D柱對大豆油樣品和加標樣品進行前處理，每個處理6個平行。各處理樣品和加標樣品色譜圖如圖6～9所示。從中可以看出，在A、B、C柱的處理樣品色譜圖中，BaP峰后均有大峰出現(xiàn)，可能樣品溶液中還含有某些物質，在與BaP相同的熒光條件下有強響應，通過調節(jié)流動相比例，可以將目標峰與雜峰分開。其中C處理色譜圖中雜峰較多，難以準確積分和定量。加標回收率和精密度檢測結果(表1)表明，A、B、C、D柱的平均回收率為91.0%～106.9%，RSD為1.4%～9.6%。比較BaP測定值，C柱處理明顯高于其他處理，并且回收率的RSD值較高，表明C柱處理所得檢測結果的可靠性和平行性欠佳。

圖6 A柱處理樣品和加標樣品色譜圖

圖7 B柱處理樣品和加標樣品色譜圖

圖8 C柱處理樣品和加標樣品色譜圖

圖9 D柱處理樣品和加標樣品色譜圖

表1 BaP加標回收率和精密度測定結果

2.5 樣品檢測

對本實驗室同一時間接收的某企業(yè)送檢油樣分別用A、B、D柱處理并檢測，每處理3個平行，檢測結果的平均值見表2，其RSD在0.3%～5.5%之間。根據(jù)GB 2762—2012規(guī)定的限量要求(≤10 μg/kg)，檢測結果報告值保留到整數(shù)位，對于BaP含量較低的植物油和基質更復雜的調和油，不同SPE柱處理組的報告值有差異。從表2可以看出，該批次樣品的BaP含量均在限量以下，為合格樣品。

表2 食用油中苯并[a]芘測定值

括號中的數(shù)值為報告值。

Values in brackets are report values.

3 討論

本文數(shù)據(jù)由工作站軟件自動積分所得，因UPLC的靈敏度遠高于HPLC，極小的響應都可以被檢測到并自動積分，尤其當BaP含量較低時，雜質可能會影響定量的準確性。

試驗選用的A柱和B柱均采用聚合物填料，通過分子印跡技術特異性吸附BaP，操作步驟相同，先依次用二氯甲烷、正己烷活化，上樣后用正己烷淋洗，再用二氯甲烷洗脫，優(yōu)點是除油效果好，耗費溶劑少，經(jīng)濟環(huán)保；但A柱處理在淋洗和洗脫過程中，液體流速較慢，有時需加壓才能流出，前處理用時比B柱處理長。C柱為改性活性炭填料，可萃取出樣品中的BaP并使其吸附，處理時因用到丙酮、正己烷、異丙醇等，操作過程相對復雜。D柱采用與國標相同的Brockmann IV級活度的中性氧化鋁為填料，柱體積大，流速快，需要加裝點膠針頭控制流速以防止油被洗脫出，因只用到正己烷，步驟最簡單，尤其適合多個樣品的同步處理，缺點是需耗費較多的溶劑。

盡管樣品經(jīng)過除油處理，但仍可能殘留油溶性雜質,特別是批量進樣后，色譜柱受污染更重，致使UPLC系統(tǒng)壓力明顯升高，很容易超過警戒最高壓力。因本實驗使用的流動相極性較強，無法徹底清洗極性較弱的油溶性雜質，可在進樣間或進樣結束后用低流速的異丙醇清洗色譜系統(tǒng)。

4 結論

本研究使用商業(yè)化BaP專用固相萃取柱凈化樣品和富集目標物，操作簡便、節(jié)省試劑、凈化效果理想。采用UPLC檢測BaP，分析速度是HPLC的3倍，并且節(jié)省了流動相，檢測結果準確可靠，尤其適用于食品批量檢測。

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Determination of benzo [a] pyrene in vegetable oil by solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-fluorescence detector. Journal of Zhejiang University (Agric. & Life Sci.), 2015,41(2):189-194

Feng Yinjie1, Qiao Yongsheng1, Chen Wei1, Feng Chengyu2, Ying Tiejin3

(1.TaizhouInstituteforFoodandDrugControl,Taizhou225300,Jiangsu,China; 2.AgriculturalCommissionofHai’anCounty,Hai’an226600,Jiangsu,China; 3.DepartmentofFoodScience&Nutrition,SchoolofBiosystemsEngineeringandFoodScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

vegetable oil; benzo [a] pyrene; solid phase extraction cartridge; ultra performance liquid chromatography; chromatographic column

聯(lián)系方式：馮寅潔，E-mail:fengyj0126@163.com

2014-09-09；接受日期(Accepted)：2014-12-17；網(wǎng)絡出版日期(Published online)：2015-03-20

TS 227

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