史雪燦，柴龍會(huì)，牛曙東，肖向紅

（東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

近年來，由于棲息環(huán)境的破壞、水源污染、微生物侵襲、疾病流行等因素，導(dǎo)致兩棲動(dòng)物的種群數(shù)量呈逐年下降趨勢(shì)［1］。已有研究表明，嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）作為一種普遍存在于兩棲類中的條件性致病菌［2］，可引起蛙類出血性敗血?。ㄋ追Q“紅腿病”），是影響其生存能力和種群數(shù)量下降的一個(gè)重要因素［3］。在微生物侵襲時(shí)，機(jī)體Toll樣受體（toll－like receptors，TLRs）不僅可以識(shí)別病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答，而且能激活信號(hào)通路調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答。其信號(hào)通路中髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）形成的復(fù)合物是多種信號(hào)向下游傳遞的共同途徑，在啟動(dòng)多種TLR 和IL－1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、激活相關(guān)信號(hào)因子中起關(guān)鍵性作用［4］。東北林蛙（Rana dybowskii）作為我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，在藥用、科研等方面具有重要價(jià)值。本試驗(yàn)以東北林蛙為試驗(yàn)對(duì)象，采用熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)東北林蛙被易感微生物嗜水氣單胞菌注射后其皮膚MyD88和TRAF6mRNA 的差異表達(dá)，以期揭示東北林蛙在識(shí)別嗜水氣單胞菌后，其機(jī)體TLR 信號(hào)通路中相關(guān)免疫分子的動(dòng)態(tài)變化，探討微生物侵襲時(shí)東北林蛙的TLR 信號(hào)調(diào)控機(jī)制，認(rèn)識(shí)兩棲類動(dòng)物機(jī)體的免疫應(yīng)答體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物及菌株 東北林蛙，105只，雄性，2歲～3 歲，2013 年9 月 采 于 黑 龍 江 省 伊 春 地區(qū)。嗜水氣單胞菌（1.1801）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，由東北林業(yè)大學(xué)動(dòng)物生理實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并凍存。

1.1.2 主 要 試 劑 TRIZOL○RReagent 為L(zhǎng)ife Technology公司產(chǎn)品；2×Taq Master Mix、50bp DNA Ladder、2.5×Real Master Mix、感受態(tài)細(xì)胞為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；pMD18－T Easy vectors、樣品保存液、Prime Script RT reagent Kit為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 嗜水氣單胞菌濃度的測(cè)定 挑嗜水氣單胞菌的單菌落于LB 液 體 培 養(yǎng) 基 中，30 ℃，180r／min搖菌24h。每隔1h吸取部分菌液，測(cè)定其OD600 nm 值，描繪生長(zhǎng)曲線。細(xì)菌計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)總細(xì)菌數(shù)。測(cè)定稀釋度分別為0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%時(shí) 菌 液 的OD600nm 值，計(jì)算試驗(yàn)所需的細(xì)菌濃度的培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.2 總RNA 提取和RT－PCR 擴(kuò)增 本試驗(yàn)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組。試驗(yàn)組東北林蛙腹腔注射濃度為107CFU／mL的嗜水氣單胞菌液1mL，注射后分別于0、2、6、12、24、48h時(shí)采集背部皮膚0.3g于離心管中，加樣品保存液，于－80 ℃冰箱中保存。對(duì)照組注射等量的LB 培養(yǎng)基后按相同方法處理。按照TRIZOL○RReagent 說 明 書，提 取 蛙 皮 膚 總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其完整性和濃度。按照Prime Script RT reagent Kit說明書，對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。

1.2.3 PCR 和電泳檢測(cè) 根據(jù)前期高通量測(cè)序所得東北林蛙基因序列，參照非洲爪蟾篩選出MyD88和TRAF6mRNA 序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)β－actin、MyD88和TRAF6 mRNA 的上下游引物并進(jìn)行合成（表1）。

表1 β－actin，MyD88和TRAF6的引物Table 1 The primers ofβ－actin，MyD88and TRAF6

按照2×Taq Master Mix說明書，以反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)所獲cDNA 為模板進(jìn)行PCR 試驗(yàn)。PCR 擴(kuò)增獲得所需片段，電泳檢測(cè)其條帶質(zhì)量。電泳后回收DNA 片段，插入到pMD18－T 載體中并轉(zhuǎn)化，經(jīng)過培養(yǎng)進(jìn)行陽性克隆篩選［5］。提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 電泳后切膠回收目的基因，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定回收片段的濃度及吸光度，將片段按10倍稀釋成6個(gè)梯度，作為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在CFX96TM Real－Time System（Bio－Rad Laboratories，Inc.）進(jìn)行。反應(yīng)按說明書進(jìn)行如下設(shè)計(jì)：2.5×Real Master Mix 9μL，正向引物2μL，反向引物2μL，cDNA 模板1μL，加ddH2O 至最終體積20μL。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3 次。反應(yīng)條件為：94 ℃2 min；94 ℃30s，55 ℃（MyD88）或54 ℃（TRAF6）30s，72 ℃30s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃5min。每1個(gè)周期在72 ℃延伸這一步驟時(shí)檢測(cè)熒光值。

1.2.5 數(shù)據(jù)收集處理和分析 用CFX Manager軟件（Bio－Rad Laboratories，Inc.）計(jì)算每個(gè)反應(yīng)的平均拷貝數(shù)和對(duì)應(yīng)的β－actin 的平均拷貝數(shù)，利用2－△△Ct法分析對(duì)照組和試驗(yàn)組MyD88 和TRAF6 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。采用SPSS（19.0）的獨(dú)立樣本T－test法檢驗(yàn)不同樣本之間表達(dá)量是否有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 嗜水氣單胞菌培養(yǎng)與濃度測(cè)定

嗜水氣單胞菌于LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，OD600nm 值為0.529，按1∶2 稀釋，細(xì)菌計(jì)數(shù)為6.6×107CFU／mL。

2.2 總RNA 提取

通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取的樣品組織總RNA 的OD 值，結(jié)果顯示各樣本OD260 nm／OD280nm 均在1.8～2.0。用15g／L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 質(zhì)量可見28S、18S、5SRNA 清晰條帶（圖1），說明樣本無蛋白質(zhì)污染，RNA 沒有降解，質(zhì)量符合試驗(yàn)要求，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 RT－PCR 擴(kuò)增結(jié)果

用500ng總RNA 進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)，得到明亮清晰的條帶（圖2），條帶長(zhǎng)度與設(shè)計(jì)時(shí)引物片段大小相吻合，經(jīng)測(cè)序顯示條帶與高通量測(cè)序結(jié)果一致。條帶單一，無雜帶、無引物二聚體及非特異性擴(kuò)增，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)的特異性引物和所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均滿足后續(xù)熒光定量PCR 試驗(yàn)的要求。

圖1 東北林蛙皮膚總RNA 電泳圖Fig.1 Results of total RNA in skin of R.dybowskii

2.4 東北林蛙皮膚MyD88和TRAF6標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

軟件CFX Manager輸出標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：

①M(fèi)yD88的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Slope＝－3.633y－int＝36.833，E＝88.5%，R2＝0.999（圖3）。②TRAF6的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Slope＝－3.443y－int＝32.176，E＝95.2%，R2＝0.998（圖4）。MyD88和TRAF6基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)和擴(kuò)增效率都滿足要求，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 RT－PCR results

2.5 東北林蛙皮膚MyD88 和TRAF6 mRNA 的熔解曲線

皮膚MyD88和TRAF6mRNA 的熔解曲線上均只有一個(gè)明顯的峰（圖5、圖6），其中MyD88 和TRAF6mRNA 的熔解溫度分別為81.5 ℃和79.5℃。結(jié)果表明熒光定量PCR 中沒有產(chǎn)生MyD88和TRAF6mRNA 的非特異性擴(kuò)增及引物二聚體，試驗(yàn)中的熒光值均來自特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖3 MyD88標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of MyD88

2.6 嗜水氣單胞菌對(duì)東北林蛙皮膚MyD88 和TRAF6mRNA 表達(dá)量的影響

嗜水氣單胞菌注射后，東北林蛙皮膚MyD88 mRNA 的表達(dá)量在2h降低了50%，6h至60%，12h達(dá)峰值為238%，24h又下降至125%，48h為122%。TRAF6 mRNA 表達(dá)量在2 h 升高至220%，6h至187%，12h達(dá)峰值為812%，24h又下降至432%，48h為254%。結(jié)果顯示細(xì)菌注射后皮膚MyD88和TRAF6mRNA 的表達(dá)量與注射前相比呈顯著性差異（P＜0.05），且在12h均呈現(xiàn)峰值，尤以TRAF6 mRNA 表達(dá)水平為最顯著，在24 h～48h仍處于較高水平，說明嗜水氣單胞菌激活了東北林蛙皮膚的TLR 信號(hào)通路并誘發(fā)了MyD88和TRAF6mRNA 的表達(dá)（圖7）。

圖4 TRAF6標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of TRAF6

圖5 皮膚MyD88mRNA 的熔解曲線Fig.5 Melt peaks of MyD88mRNA in skin

圖6 皮膚TRAF6mRNA 的熔解曲線Fig.6 Melt peaks of TRAF6mRNA in skin

圖7 嗜水氣單胞菌注射后東北林蛙皮膚MyD88和TRAF6mRNA 的表達(dá)量變化Fig.7 Real－time PCR analysis of MyD88and TRAF6mRNA expressions in skin following exposure to Ah

3 討論

Toll樣受體不僅是固有免疫應(yīng)答中識(shí)別病原相關(guān)分子模式（PAMP）的主要受體，而且其激活的信號(hào)通路還能調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答［6］。哺乳動(dòng)物研究顯示，MyD88是Toll受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中非常重要的銜接分子之一，也是多種TLR／IL－1信號(hào)途徑向下游傳遞的關(guān)鍵分子［7］。在MyD88 介導(dǎo)的TLR 信號(hào)通路中，MyD88 活化后可誘導(dǎo)白介素－1受體相關(guān)激酶（interleukin－1receptor－associated kinases，IRAKs）磷酸化，進(jìn)一步激活胞漿內(nèi)TRAF6使之活化，最終激活細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（nuclear factor kappa－light－chain－enhancer of activated B cells，NF－κB）。胞漿中活化后的NF－κB 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，引起多種促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)［8－10］。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，東北林蛙在注射嗜水氣單胞菌后，MyD88和TRAF6mRNA 的表達(dá)量均發(fā)生明顯變化，且均在12h呈現(xiàn)峰值。TRAF6mRNA 表達(dá)水平為最顯著，在24h～48h仍維持較高水平。說明注射嗜水氣單胞菌后，東北林蛙皮膚的TLRs信號(hào)通路被激活，MyD88和TRAF6mRNA 的表達(dá)量上升，東北林蛙體內(nèi)存在MyD88－TRAF6這一通路，在微生物入侵時(shí)，這一通路被激活，參與東北林蛙機(jī)體的早期免疫應(yīng)答并發(fā)揮作用。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究表明，MyD88不僅在TLR 信號(hào)途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，還通過影響相關(guān)細(xì)胞因子的分泌來參與多種免疫應(yīng)答［11］，在抗感染免疫、傳遞上游信息、連接下游信號(hào)和疾病免疫應(yīng)答中具有重要的作用［12－13］。在MyD88依賴的信號(hào)通路中，TRAF6是必需的連接分子。MyD88 與TRAF6 形成的復(fù)合物，在啟動(dòng)多種TLR 和IL－1R 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、激活相關(guān)信號(hào)因子中起關(guān)鍵性作用［14］，是多種信號(hào)向下游傳遞的共同途徑。這與本研究中MyD88 與TRAF6mRNA 表達(dá)共同出現(xiàn)峰值的結(jié)果相吻合。O′Neill發(fā)現(xiàn)，TRAF6是免疫過程中的關(guān)鍵信號(hào)分子，不僅參與TLR／IL－1天然免疫和適應(yīng)性免疫，且對(duì)IL－1、LPS 等促炎因子的應(yīng)答起著重要作用［15－16］。本試驗(yàn)中嗜水氣單胞菌被注射到東北林蛙24h 后，MyD88 mRNA 的表達(dá)量回落明顯，而TRAF6mRNA 表現(xiàn)出432%的表達(dá)量。由此推測(cè)，在TLR 信號(hào)通路啟動(dòng)后，TRAF6 被大量激活并長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)揮效應(yīng)。但究竟是MyD88直接激活TRAF6來發(fā)揮作用，還是MyD88和TRAF6的表達(dá)激活下游效應(yīng)因子而產(chǎn)生效應(yīng)，尚需進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)對(duì)東北林蛙TLR 信號(hào)通路進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，東北林蛙在識(shí)別嗜水氣單胞菌后，其機(jī)體TLR 信號(hào)通路中的相關(guān)免疫分子MyD88和TRAF6均發(fā)生了顯著性差異，說明TLR 信號(hào)通路在蛙類的抗細(xì)菌感染中發(fā)揮重要作用，是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，也是蛙類在水生環(huán)境中生存的重要保護(hù)屏障。

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