張蕾蕾，余永濤，何生虎，趙清梅，葛 松

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021；2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川750021；3.國家民委發(fā)酵釀造工程生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川750021；4.韓城市金城辦畜牧獸醫(yī)工作站，陜西韓城715400）

瘋草是棘豆屬和黃芪屬有毒植物的統(tǒng)稱，其主要毒性成分為苦馬豆素（swainsonine，SW）。動(dòng)物采食瘋草后可引起以神經(jīng)系統(tǒng)紊亂為特征的瘋草中毒病［1］，但瘋草中SW 的合成機(jī)理一直未被闡明。研究表明，瘋草內(nèi)普遍存在能合成苦馬豆素的內(nèi)生真菌－Undifilum oxytropis，該內(nèi)生真菌與瘋草毒性密切相關(guān)［2－10］，是瘋草中合成苦馬豆素的主要因素。抑制或消除瘋草內(nèi)產(chǎn)SW 內(nèi)生真菌將有望降低或消除瘋草的毒性，要實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)需要對(duì)瘋草內(nèi)生真菌合成SW 的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入的研究。

原生質(zhì)體是指完整細(xì)胞剝除細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)后所形成的裸露細(xì)胞，為球狀的單細(xì)胞，對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)劑敏感，易于攝取外源大分子、細(xì)胞器及細(xì)菌和病毒，是真菌遺傳轉(zhuǎn)化和功能研究的重要工具。自Ferenczy L等［11］成功將細(xì)胞融合技術(shù)引入絲狀真菌的研究領(lǐng)域，原生質(zhì)體技術(shù)陸續(xù)被應(yīng)用于絲狀真菌融合育種、質(zhì)粒及線粒體等外源基因的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種、誘變?cè)偕N及遺傳性狀表達(dá)和分析研究中。原生質(zhì)體的制備方法主要分為機(jī)械法、酶解法和超聲法3種，其中酶解法條件比較溫和、制備量大、對(duì)原生質(zhì)體的損傷小，是目前應(yīng)用最為普遍的絲狀真菌制備方法。研究報(bào)道滲透壓穩(wěn)定劑、溫度、pH、酶解孵育方式及培養(yǎng)基組分等因素對(duì)菌株原生質(zhì)體的形成和再生均具有不同程度的影響［12－16］。

瘋草內(nèi)生真菌原生質(zhì)體的制備可為進(jìn)行瘋草內(nèi)生真菌的遺傳轉(zhuǎn)化和基因研究提供重要工具，為進(jìn)一步研究確定瘋草內(nèi)生真菌合成SW 的相關(guān)基因功能，闡明分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)擬采用酶解法制備瘋草內(nèi)生真菌的原生質(zhì)體，并對(duì)獲得的原生質(zhì)體進(jìn)行生物學(xué)特性的初步研究，為進(jìn)一步研究瘋草內(nèi)生真菌合成SW 相關(guān)基因的功能提供轉(zhuǎn)化工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 瘋草內(nèi)生真菌菌株U.oxytropis NX－FEL001，由寧夏大學(xué)臨床獸醫(yī)學(xué)自治區(qū)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室從寧夏黃花棘豆中分離鑒定并保存［9］。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA 固體培養(yǎng)基，馬鈴薯浸粉瓊脂培養(yǎng)基，蛋白胨無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基［10］，CM 培養(yǎng)基［14］，酵母浸膏完全培養(yǎng)基（YCM）［14］，PDA 液體培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑和儀器 SW 標(biāo)準(zhǔn)品由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院臨床獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室從黃花棘豆草粉中分離和純化；蝸牛酶（snailase）、溶壁酶（lysing enzyme）、纖維素酶（cellulase）為Sigma公司產(chǎn)品；山梨醇、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂等為國產(chǎn)分析純。

裂解酶溶液的配制：分別稱取1g蝸牛酶，1g纖維素酶，0.1g的溶壁酶，加入少量無菌的1mol／L的山梨醇溶解，定容至100mL，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾除菌，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 主要儀器設(shè)備 RE－52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；KG－SX－500型高壓鍋為三洋電機(jī)株式會(huì)社日本產(chǎn)品；MIP－250型霉菌培養(yǎng)箱為上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；QYC－2102C型搖床為上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為Thermo Fisher公司產(chǎn)品；E438酸度計(jì)為Mettler Toledo 有限公司產(chǎn)品；超純水儀為Thermo Fisher公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)為Eppendorf公司產(chǎn)品；數(shù)碼照相機(jī)為日本佳能公司產(chǎn)品；Neofugel 5R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)為上海力申科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；CKx41SF 倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng) 固體培養(yǎng)：將U.oxytropis NX－FEL001菌株接種于PDA 固體培養(yǎng)基22 ℃培養(yǎng)30d后，無菌刮取菌絲，將收集的菌絲用研磨棒研磨制備成均一的菌懸液（1×106個(gè)／mL）。取500μL涂布于蛋白胨無機(jī)鹽固體平板上，22 ℃靜置培養(yǎng)7d～30d，培養(yǎng)結(jié)束后，無菌刮取菌絲，將菌絲用研磨棒研磨成勻漿，并用1.0 mol／L 山梨醇溶劑洗滌3次。

液體培養(yǎng)：用打孔器取直徑6 mm 的菌餅（15個(gè)／瓶）接種到100 mL PDA 液體培養(yǎng)基中，22 ℃振 蕩 培 養(yǎng)7 d ～30 d，培 養(yǎng) 結(jié) 束 后，5 000r／min，離心30min，棄上清，將菌絲用研磨棒研磨成勻漿，并用1.0mol／L山梨醇劑洗滌3次。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備 稱量培養(yǎng)好的濕的菌絲體400mg，按質(zhì)量體積比為1∶10加入4mL 裂解酶液，35℃，80r／min振蕩孵育，分別在孵育后1、2、3、4、4.5h取孵育的菌絲懸液于血球計(jì)數(shù)板上，置顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體的數(shù)量，篩選適宜的酶解時(shí)間。酶解結(jié)束后，加入0.5倍酶體積的1.0mol／L山梨醇，渦旋混勻，3 層擦鏡紙過濾除去殘余的菌絲，先用5mL 的1.0mol／L 山梨醇沖洗2次，濾液5 000r／min離心15 min，棄上清，再用5mL的1.0mol／L山梨醇重懸，5 000r／min離心15min，棄上清，此過程重復(fù)3次，將制備好的原生質(zhì)體重懸于適量的1.0mol／L山梨醇，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 培養(yǎng)方式的篩選 分別取1.2.1中固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)的菌絲，按1.2.2中試驗(yàn)步驟制備原生質(zhì)體，分別比較菌絲培養(yǎng)7d后固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)的方式原生質(zhì)體的產(chǎn)量。

1.2.4 菌齡的篩選 取固體培養(yǎng)的菌絲，按1.2.2中的試驗(yàn)步驟制備原生質(zhì)體，分別比較菌齡為7、15、30、35d時(shí)原生質(zhì)體的產(chǎn)量。

1.2.5 孵育溫度和孵育時(shí)間的篩選 固體培養(yǎng)15d的菌絲，以10g／L蝸牛酶＋10g／L纖維素酶＋1g／L溶壁酶組成的復(fù)合酶溶液為酶解系統(tǒng)。據(jù)報(bào)道，絲狀真菌菌絲細(xì)胞壁的酶解最適溫度一般為20 ℃～40℃，因此本試驗(yàn)分別比較28、30、35、37℃時(shí)孵育3h后原生質(zhì)體的產(chǎn)量；35 ℃孵育1、2、3、4、4.5h后原生質(zhì)體的產(chǎn)量。

1.2.6 菌絲與酶解液質(zhì)量體積比的篩選 固體培養(yǎng)15d的菌絲，以10g／L 蝸牛酶＋10g／L 纖維素酶＋1g／L溶壁酶組成的復(fù)合酶溶液為酶解系統(tǒng)，分別比較質(zhì)量體積比為1∶10、1∶25時(shí)，原生質(zhì)體的釋放量。

1.2.7 原生質(zhì)體的再生 將新鮮制備的原生質(zhì)體2倍稀釋，取200μL分別涂布于含有1.0mol／L 山梨醇的PDA 固體培養(yǎng)基、馬鈴薯浸粉培養(yǎng)基、YCM瓊脂培養(yǎng)基、CM 瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，置22 ℃培養(yǎng)15d，對(duì)形成的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)（A），為消除由殘余菌絲再生出的菌落所帶來的誤差，同時(shí)將原生質(zhì)體涂布于未添加1.0mol／L 山梨醇的培養(yǎng)基上，其再生菌落數(shù)作為對(duì)照（B），并根據(jù)下列公式計(jì)算不同培養(yǎng)基中原生質(zhì)體的再生率。

1.2.8 再生菌絲及野生菌株菌絲中SW 的檢測

1.2.8.1 再生菌絲及野生菌株菌絲中SW 的提取分別刮取再生出的真菌菌絲和野生菌株菌絲0.5g～1g，65 ℃烘至恒重，然后研磨成粉末于10mL離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)為30mL／L 的乙酸溶液8mL，60℃超聲波提取3次，每次30min，合并3次提取液，3 000r／min 離心15 min，收集上清液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮揮干［12］。2mL 的pH 4.5檸檬酸鹽緩沖液溶解，12 000r／min離心5 min，取上清液，用pH 4.5 檸檬酸鹽緩沖液定容至10 mL，4 ℃保存待用。

1.2.8.2 再生菌絲及野生菌株菌絲中SW 含量的檢測 分別配制4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625μg／mL等9個(gè)梯度的SW 標(biāo)準(zhǔn)溶液。取40μL不同濃度的苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別加入96孔板的各孔中，每個(gè)濃度的溶液同時(shí)做3個(gè)重復(fù)，另將60μL 檸檬酸鹽緩沖液加入空白孔中作為空白對(duì)照，然后在每孔中加入95μL 的底物溶液，輕微振蕩混勻，置37 ℃孵育1h；孵育結(jié)束后在每孔加入20μL的酶溶液，但空白對(duì)照中不加酶溶液，輕微振蕩混勻，置37 ℃孵育1h。孵育結(jié)束后，每孔加入100μL 的反應(yīng)終止液，輕微振蕩混勻，置405nm 波長處測定各孔吸光度值。以ɑ－甘露糖苷酶抑制率y對(duì)SW 濃度x進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將1.2.8.1中制備的待檢液做適當(dāng)?shù)南♂尯?，然后按照上述的方法測定其中SW 的含量，將ɑ－甘露糖苷酶的抑制率代入回歸方程計(jì)算出樣品溶液中SW 的含量，并與野生型菌株中SW 含量作對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 原生質(zhì)體的制備

2.1.1 原生質(zhì)體的形成及釋放 當(dāng)酶反應(yīng)1h后，菌絲部分隔膜開始斷裂（圖1A）；反應(yīng)2h后，菌絲的隔膜完全溶解，呈念珠狀（圖1B），此時(shí)原生質(zhì)體開始從菌絲側(cè)面的細(xì)胞壁破口處釋放出來（圖1C）；反應(yīng)3h～4h后，菌絲中大量細(xì)胞破壁，原生質(zhì)體大量的釋放，其濃度達(dá)105個(gè)／mL以上，呈圓球形散在分布（圖1D）。

圖1 Undifilum oxytropis NX－FEL001原生質(zhì)體的形成過程Fig.1 Process of release of the Undifilum oxytropis NX－FEL001protoplast

2.1.2 真菌培養(yǎng)方式對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，在裂解酶溶液的作用下，固體和液體振蕩培養(yǎng)的NX－FEL001 的菌絲細(xì)胞壁均可被溶解，但固體培養(yǎng)方式獲得的真菌菌絲經(jīng)裂解液作用后產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量要顯著高于液體振蕩培養(yǎng)方式，原生質(zhì)體的產(chǎn)量高達(dá)0.5×105個(gè)／mL，而液體振蕩培養(yǎng)原生質(zhì)體的產(chǎn)量僅為0.4×105個(gè)／mL。

2.1.3 菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 處于不同生長時(shí)期的菌絲體對(duì)酶解液的敏感程度也存在較大的差異，當(dāng)培養(yǎng)7d時(shí)，菌絲細(xì)胞壁過早溶解，并導(dǎo)致原生質(zhì)體發(fā)生自溶，釋放量少；當(dāng)菌齡為15d時(shí)，真菌細(xì)胞壁逐漸增厚，但又不會(huì)過多損傷釋放的原生質(zhì)體，原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高。但隨著菌齡的增加，菌絲體細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)越趨穩(wěn)定，對(duì)酶解液的敏感度下降，原生質(zhì)體產(chǎn)量趨向于降低（圖2）。

圖2 菌齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of cultivation time on protoplast yield

2.1.4 孵育溫度和孵育時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響 結(jié)果表明，35 ℃時(shí)原生質(zhì)體的釋放量最大，原生質(zhì)體的制備率最高，可達(dá)2.7×105個(gè)／mL。酶解液孵育1h后，僅有部分菌絲的細(xì)胞壁溶解，并釋放出少量的原生質(zhì)體，但隨著孵育時(shí)間的延長，大部分菌絲的細(xì)胞壁溶解，釋放的原生質(zhì)體逐漸增加，當(dāng)孵育3h時(shí)，從溶解的菌絲中釋放的原生質(zhì)體的數(shù)量最多，孵育4h后其數(shù)量反而降低（圖3A）。可能因?yàn)槊附獾臅r(shí)間過長，原生質(zhì)體的質(zhì)膜損傷，導(dǎo)致原生質(zhì)體破碎。因此，本試驗(yàn)確定最佳孵育時(shí)間是3h（圖3B）。

圖3 孵育溫度和時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of digesting temperature and time on protoplast yields

2.1.5 菌絲與酶解液質(zhì)量體積比對(duì)原生質(zhì)體釋放量的影響 結(jié)果顯示，菌絲和酶解液的質(zhì)量體積之比為1∶10 時(shí)，有利于原生質(zhì)體的釋放，釋放量達(dá)3.2×105個(gè)／mL；菌絲和酶解液的質(zhì)量體積之比為1∶25時(shí)，原生質(zhì)的釋放量達(dá)2.5×105個(gè)／mL，遠(yuǎn)小于質(zhì)量體積比為1∶10時(shí)原生質(zhì)體的釋放量。

2.2 原生質(zhì)體的再生

2.2.1 再生培養(yǎng)基組分對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響

菌株NX－FEL001原生質(zhì)體可分別在含1 mol／L山梨醇的蛋白胨無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基、馬鈴薯浸粉瓊脂培養(yǎng)基、PDA 固體培養(yǎng)基、CM 瓊脂培養(yǎng)基、YCM瓊脂培養(yǎng)基上再生，但不同培養(yǎng)基上的再生能力存在一定的差異，其再生率分別為6.7%、6.4%、7.1%、7.9%、8.5%，其中在YCM 培養(yǎng)基上再生能力最強(qiáng)，而在馬鈴薯浸粉瓊脂培養(yǎng)基上再生能力較差（圖4）。

圖4 再生培養(yǎng)基的組分對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響Fig.4 Effects of regeneration medium on protoplast regeneration rate

2.2.2 再生真菌的形態(tài)特征 純化的原生質(zhì)體，22 ℃培養(yǎng)30d后，在YCM 瓊脂培養(yǎng)基上的菌落呈現(xiàn)白色（圖5A），而在其他培養(yǎng)基上再生出的菌落呈黑褐色，與野生菌株相一致（圖5B～圖5D），但不同再生培養(yǎng)基上菌絲的鏡下顯微形態(tài)無明顯差異，與野生菌株的形態(tài)特征相一致（圖5E，圖5F）。

2.2.3 再生真菌中SW 的含量 通過對(duì)原生質(zhì)體再生后菌落菌絲中SW 含量的檢測，發(fā)現(xiàn)再生的真菌仍具備合成SW 的能力，其菌絲中SW 含量為168.3μg／g，野生型菌絲中的SW 含量為165.6μg／g。

3 討論

目前，子囊菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)相對(duì)比較成熟，但是因?yàn)楫a(chǎn)SW 瘋草內(nèi)生真菌生長比較緩慢，不容易獲得該內(nèi)生真菌的原生質(zhì)體，原生質(zhì)體技術(shù)在該類真菌上的應(yīng)用還處在發(fā)展的過程中。原生質(zhì)體的制備是一切原生質(zhì)體操作技術(shù)的前提，裂解酶的種類、配比、酶解的時(shí)間、溫度、滲透壓穩(wěn)定劑等都會(huì)不同程度的影響原生質(zhì)體的釋放和再生能力。

在本試驗(yàn)中U.oxytropis菌絲在蛋白胨無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上22 ℃培養(yǎng)15d，按照菌絲與酶解液質(zhì)量體積比為1∶10，35 ℃恒溫、80r／min振蕩孵育3 h，原生質(zhì)體釋放量最高；原生質(zhì)體在YCM 培養(yǎng)基上，22 ℃培養(yǎng)9d可以再生形成菌落，培養(yǎng)15d其再生率可達(dá)8.5%；原生質(zhì)體在YCM 培養(yǎng)基上再生后其菌落顏色與野生型U.oxytropis不一致，呈白色，其他培養(yǎng)基上再生后的菌落顏色與野生型菌株相一致。菌絲形態(tài)與野生型U.oxytropis相一致，經(jīng)檢測再生后菌絲仍然能夠產(chǎn)生苦馬豆素，與Mukherjee S等［15－16］研究結(jié)果相一致。原生質(zhì)體的制備只是去除了真菌細(xì)胞的細(xì)胞壁。原生質(zhì)體的再生過程是細(xì)胞壁再生過程，并未改變真菌的遺傳性狀，不會(huì)影響菌株合成SW 的能力。

圖5 再生真菌的形態(tài)特征觀察Fig.5 Morphological observation of mycelia

菌絲細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)的形成受培養(yǎng)方式的影響，間接地影響菌絲對(duì)裂解酶的敏感程度。本試驗(yàn)評(píng)估了液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的方式對(duì)原生質(zhì)體釋放的效果，表明固體培養(yǎng)菌絲能釋放出更多的原生質(zhì)體，與朱建勇等［13］研究結(jié)果一致。固體培養(yǎng)基獲得的真菌培養(yǎng)物中的菌絲體排列較疏松，經(jīng)研磨后，菌絲體能夠與酶解液充分接觸，有利于原生質(zhì)體的釋放。而液體振蕩培養(yǎng)后所得的真菌培養(yǎng)物呈球狀、索狀，菌絲體排列致密，導(dǎo)致菌絲與酶解液不能完全充分的接觸，將不利于原生質(zhì)體的釋放。

菌絲處于不同生長時(shí)期，其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)組成有所不同。菌齡過小，細(xì)胞壁薄，酶解后所形成的原生質(zhì)體大小不均勻，且容易溶解；菌齡過大，菌絲細(xì)胞壁較厚，細(xì)胞壁不易破碎，不利于原生質(zhì)的釋放［12］。本試驗(yàn)最終確定22 ℃培養(yǎng)15d，有利于U.oxytropis原生質(zhì)體的釋放。

酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，幾乎所有酶參與的反應(yīng)都受溫度、時(shí)間條件的影響。不同種類的酶都有其作用的最適溫度、時(shí)間，在該溫度、時(shí)間下其活性最高，偏離該溫度、時(shí)間，酶的活性將會(huì)受到抑制，甚至變性失去活性；酶解溫度越低、時(shí)間過短，菌絲質(zhì)膜不能完全溶解，細(xì)胞壁不能徹底被剝除，原生質(zhì)體制備率過低；孵育溫度過高、時(shí)間過長，會(huì)對(duì)一些早期釋放的原生質(zhì)體質(zhì)膜造成損傷，導(dǎo)致原生質(zhì)體的穩(wěn)定性下降［13］。本試驗(yàn)最終確定35 ℃恒溫孵育3h，混合酶液活性最佳，原生質(zhì)體的釋放量最大，高達(dá)2.7×105個(gè)／mL。

菌絲與酶解液的質(zhì)量體積比過大，不利于菌絲與混合酶解液的接觸，細(xì)胞壁破損不完全，阻礙了原生質(zhì)體的釋放；菌絲與酶解液的質(zhì)量體積比過小，混合酶液濃度相對(duì)過大，會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體的質(zhì)膜破損和溶解，降低其再生能力。試驗(yàn)最終確定菌絲與酶解液的質(zhì)量體積比1∶10。

再生培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)的方式會(huì)影響原生質(zhì)體細(xì)胞壁的再生能力，導(dǎo)致再生率不同［13］。本試驗(yàn)只做了5種固體培養(yǎng)方面的研究，發(fā)現(xiàn)YCM 培養(yǎng)基上再生效果最好，與徐峰等［14］試驗(yàn)結(jié)果相一致。有關(guān)原生質(zhì)體在液體培養(yǎng)基中再生菌絲的形態(tài)及再生能力有待進(jìn)一步研究。

U.oxytropis原生質(zhì)體的制備及再生為進(jìn)一步研究SW 合成機(jī)理及產(chǎn)SW 內(nèi)生真菌原生質(zhì)體的制備提供思路，為后續(xù)開展U.oxytropis菌株原生質(zhì)體誘變、融合、轉(zhuǎn)化、誘變育種奠定基礎(chǔ)。一方面從瘋草毒性來說，通過原生質(zhì)體技術(shù)構(gòu)建低毒或無毒的瘋草；另一方面，從SW 藥用價(jià)值來說，通過該技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)SW 的突變菌株。

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