劉相葉，武志強(qiáng)，劉轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，湯仁仙，顏 超，鄭葵陽(yáng)＊

（1.徐州醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫教研室，感染與免疫實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221004；2.Department of Biology，Colorado State University，F(xiàn)ort Collins，Colorado，80523，USA）

人粒細(xì)胞無(wú)形體病（Human granulocytic anaplasmosis，HGA）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的新發(fā)人獸共患病，其病原體為嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體（Anaplasma phagocytophilum），是一種細(xì)胞內(nèi)專性寄生的革蘭陰性菌，屬立克次體目（Rickettsiales）無(wú)形體科（Anaplasmataceae）無(wú)形體屬（Anaplasmas），可以感染人、嚙齒動(dòng)物和反芻動(dòng)物等多種哺乳動(dòng)物［1－3］。硬蜱是介導(dǎo)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體在人、家畜和野生動(dòng)物之間循環(huán)傳播的主要媒介，我國(guó)分布廣泛的全溝硬蜱、森林革蜱、長(zhǎng)角血蜱等均被視為嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的傳播媒介［4］。血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)HGA的流行呈現(xiàn)農(nóng)村高于城市的趨勢(shì)（農(nóng)村為15.4%，城市為1.5%）［5］，這可能與嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體在家畜和硬蜱體內(nèi)的高感染率有關(guān)（山羊26.69%、牛23.38%、長(zhǎng)角血蜱43.5%）［6－7］。

山東省沂源縣地處魯中腹地，自2004年以來(lái)，不斷有當(dāng)?shù)剞r(nóng)民確診HGA 的報(bào)告；血清學(xué)調(diào)查顯示，這些農(nóng)民HGA 抗體陽(yáng)性率是全國(guó)平均水平的2倍［5，8］。該地區(qū)農(nóng)民除作物耕種以外，多從事山羊養(yǎng)殖。每年春夏季節(jié)的蜱蟲(chóng)活躍期，山羊體表有大量的硬蜱寄生，并且時(shí)有蜱咬人事件的發(fā)生。為了解這一地區(qū)硬蜱感染嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的情況，本課題組于2015年5月～7月的硬蜱活躍期，以家養(yǎng)或野外放養(yǎng)山羊?yàn)閷?duì)象，采集寄生于山羊體表的硬蜱。采用套式PCR 擴(kuò)增嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的16SrRNA基因片段并測(cè)序，鑒定蜱蟲(chóng)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體并分析其16SrRNA 基因的變異情況，為當(dāng)?shù)豀GA 的預(yù)防提供參考意見(jiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 調(diào)查地點(diǎn) 沂源縣位于山東省中部，是淄博、萊蕪、臨沂、濰坊四市的結(jié)合部，地理坐標(biāo)：東經(jīng)117°54′～118°31′，北緯35°55′～36°23′之間，屬溫帶季風(fēng)區(qū)域大陸性氣候。

1.1.2 樣本采集 本次調(diào)查選取有疑似HGA 病例的自然村開(kāi)展硬蜱調(diào)查，采用體表視檢法采集不同地區(qū)家養(yǎng)或野外放牧山羊體表寄生的硬蜱。采集的硬蜱保存在通氣干燥的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，12h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分類鑒定和病原檢測(cè)。

1.1.3 主要試劑 DNA 提取試劑盒，德國(guó)QIAGEN 公司產(chǎn)品；Taq DNA 聚合酶、10×PCR 緩沖液、dNTP混合物，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；無(wú)水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［7，9］，合成無(wú)形體16SrRNA 基因內(nèi)外引物各一對(duì)，蜱蟲(chóng)16SrRNA基因引物一對(duì)；引物名稱及序列見(jiàn)表1。所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用滅菌去離子水稀釋至100μmol／L分裝，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR 引物Table 1 The primers for PCR

1.2.2 樣本DNA 的提取 采集的硬蜱樣本分類鑒定后分組，若蜱每組3只～4只，成蜱每組1只。每組單獨(dú)放在含有750mL／L 酒精的EP 管內(nèi)浸泡30min，再用滅菌去離子水洗滌3次，晾干。分別置于含有200μL 1×PBS 的研磨管內(nèi)，在快速樣品均質(zhì)器上室溫條件下均質(zhì)，均質(zhì)程序?yàn)椋?m／s運(yùn)行40 s，暫停300s，共2個(gè)循環(huán)。稍離心后，取180μL 均質(zhì)液，置于滅菌EP管內(nèi)，按照DNA 提取試劑盒說(shuō)明提取樣本DNA。按同樣操作提取無(wú)菌水作陰性對(duì)照。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 無(wú)形體16SrRNA 基因的擴(kuò)增采用套式PCR，第一輪擴(kuò)增使用通用引物EH－out1和EH－out2，25μL 反應(yīng)體系成分如下：1.2.2中提取的DNA 1μL 為模板，加入相應(yīng)的上、下游引物（10μmol／L）各1 μL，Ex Taq DNA 聚 合 酶（5 U／μL）0.1 μL，10×PCR 緩 沖 液（20 mmol／L Mg2＋Plus）2.5μL和dNTP 混合物（2.5mmol／L）2.0μL，補(bǔ)去離子滅菌水到25μL，瞬時(shí)離心混勻。反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃45s，55℃50s，72℃1min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。第2輪反應(yīng)以1μL第一輪產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增使用特異性引物HGA1和HGA2，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同第一輪，擴(kuò)增片段預(yù)期大小為389bp。取10μL 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)10g／L的瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果。

1.2.4 序列分析 無(wú)形體16SrRNA 基因片段的PCR 產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳鑒定大小正確后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交GenBank并進(jìn)行16SrRNA 基因序列核苷酸同源性比較和查詢，并采用ClustalX2.0進(jìn)行多序列的排列和進(jìn)化軟件MrBaye3.2.5 繪制基因進(jìn)化樹(shù)［10］。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)查地區(qū)概況

山東沂源縣屬中低山丘陵區(qū)，多山林、草地，農(nóng)業(yè)人口占80%，當(dāng)?shù)剞r(nóng)民多從事經(jīng)濟(jì)作物種植與畜牧養(yǎng)殖（以養(yǎng)殖波爾山羊、黑山羊及紅山羊?yàn)橹鳎?。山羊主要以野外山林放養(yǎng)為主，體表寄生有大量硬蜱，雖做殺蟲(chóng)處理，但是效果不理想（圖1）。人與家畜接觸密切，常有蜱蟲(chóng)叮咬事件的發(fā)生。

圖1 長(zhǎng)角血蜱寄生于紅山羊耳背面Fig.1 H.longicornis on the back of red goat

2.2 樣本采集

本次調(diào)查從波爾山羊、黑山羊、紅山羊體表共采集硬蜱923只，經(jīng)形態(tài)學(xué)與蜱蟲(chóng)16SrRNA 擴(kuò)增鑒定均為長(zhǎng)角血蜱，隨機(jī)選取其中126 只（包括成蜱43只、若蜱83只），分別提取其核酸后做嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體病原檢測(cè)。

2.3 PCR 擴(kuò)增

將126只硬蜱分為54組，分別提取DNA 進(jìn)行套式PCR 擴(kuò)增。26組產(chǎn)生389bp大小的預(yù)期片段（圖2），擴(kuò)增陽(yáng)性率為48.1%。

2.4 序列分析

26份陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物全部測(cè)序成功，將陽(yáng)性序列（362bp）利用ClustalX2.0進(jìn)行比對(duì)，按照100%相似性進(jìn)行歸類，結(jié)果共檢出7類變異株（分別命名為YT1～YT7，GenBank 注 冊(cè) 號(hào) 為 KT276559 ～KT276565），其中YT5 同其他序列存在顯著差異（圖3）。YT1占檢出序列的11.5%（3／26）與2012年日本全溝硬蜱體內(nèi)檢出的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體序列（JQ622148）的同源性達(dá)99%，并且與2007年山東沂源發(fā)熱病人體內(nèi)檢出的無(wú)形體序列YYH3（EU982709）保持較近的進(jìn)化關(guān)系（圖4）；YT2占檢出序列的50%（13／26）是本次所有檢出變異株中的優(yōu)勢(shì)菌株，與2010年日本長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)檢出的牛無(wú)形體序列（EU181143）同源性達(dá)98%，同時(shí)與YT7保持密切的遺傳關(guān)系（圖4）；YT3 占檢出序列的11.5%（3／26），與2010年我國(guó)湖北隨州長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)檢出的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體序列（HM641751）具有99%的同源性，遺傳進(jìn)化分析顯示YT3與2007年山東沂源山羊體內(nèi)檢出的無(wú)形體序列YYS3（EU982704）遺傳關(guān)系較近（圖4）；YT4和YT6均占檢出序列的0.4%（1／26）與2009年北京牛體內(nèi)檢出的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體序列（GQ500018）同源性較高，并與2007年山東沂源長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)檢出的無(wú)形體序列（EU982710）保持密切的遺傳關(guān)系（圖4）。

圖2 長(zhǎng)角血蜱標(biāo)本DNA 提取物PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR results of 16SrRNA gene of Anaplasmain H.longicornis samples

圖3 無(wú)形體16SrRNA 基因序列比對(duì)結(jié)果Fig.3 Multiple sequence alignment analysis of 16SrRNA gene of Anaplasma

圖4 無(wú)形體16SrRNA 基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenic tree of 16SrRNA gene of Anaplasma

3 討論

嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的主要傳播媒介是硬蜱［11］。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在我國(guó)的全溝硬蜱、森林革蜱、長(zhǎng)角血蜱等體內(nèi)均可檢測(cè)到嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的16S rRNA 基 因 序 列［12－14］。山 東 省 沂 源 縣 地 處 魯 中 腹地，是淄博、萊蕪、臨沂、濰坊四市的交界處，家畜及野生動(dòng)物流動(dòng)較大。長(zhǎng)角血蜱作為該地區(qū)的優(yōu)勢(shì)蜱種，大量寄生于家畜體表，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了極大的危害；而且常有蜱咬人事件發(fā)生，給當(dāng)?shù)鼐用窠】祹?lái)了嚴(yán)重威脅。本次調(diào)查結(jié)果顯示，山東沂源長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的陽(yáng)性率為48.1%，明顯高于2009年本地硬蜱體內(nèi)17.6%的陽(yáng)性檢出率［8］，同時(shí)也高于山東萊州灣地區(qū)長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)43.5%的陽(yáng)性檢出率［7］，說(shuō)明該地區(qū)是人粒細(xì)胞無(wú)形體病的重要自然疫源地。

本次調(diào)查采用具有高度保守的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體16SrRNA 基因作為分類和鑒定標(biāo)準(zhǔn)。54份長(zhǎng)角血蜱標(biāo)本中，26份擴(kuò)增出嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的16 S rRNA 基因，提示山東沂源地區(qū)山羊體表寄生的長(zhǎng)角血蜱存在較高的無(wú)形體感染率，而山羊極有可能是該地區(qū)無(wú)形體病的重要儲(chǔ)存宿主。將測(cè)序獲得的16SrRNA 基因序列（362bp）進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，26份樣本中存在7個(gè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的變異株，但其中1株（YT5）與其他6株存在較大差異，可能是測(cè)序或克隆錯(cuò)誤所致。其余5 株16SrRNA基因序列分別與中國(guó)湖北隨州長(zhǎng)角血蜱、北京牛、日本全溝硬蜱體內(nèi)檢出的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體序列保持非常高的同源性，但相似性未達(dá)到100%，說(shuō)明不同地方嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體會(huì)存在一定的變異。還有1株與日本長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)檢出的牛無(wú)形體同源性較高，可能是由于389bp 16SrRNA 基因的測(cè)序只能初步鑒定出嗜吞噬無(wú)形體感染的陽(yáng)性樣本，但是不能準(zhǔn)確鑒定無(wú)形體屬種型有關(guān)［15］。遺傳進(jìn)化分析顯示，6個(gè)變異株均與2007 年山東沂源發(fā)熱病人、山羊、長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)檢出的無(wú)形體保持非常密切的遺傳進(jìn)化關(guān)系，說(shuō)明該地區(qū)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的不同變異株可能來(lái)自同一祖先，但是否是同一基因型，還需要進(jìn)一步研究。

結(jié)合以往的HGA 現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)與實(shí)驗(yàn)室調(diào)查［8，16］，本研究可以證實(shí)山東省沂源地區(qū)是重要的HGA 自然疫源地。值得我們注意的是，作為該病媒介的長(zhǎng)角血蜱的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的攜帶率比2009年增長(zhǎng)了1.7倍［8］，并且該地區(qū)出現(xiàn)了更多的變異株。山東沂源地區(qū)大部分山羊都由農(nóng)民放養(yǎng)，山羊體表寄生有大量長(zhǎng)角血蜱，農(nóng)民和基層獸醫(yī)與山羊都有著密切地接觸，隨時(shí)有被蜱蟲(chóng)叮咬的可能。所以有必要對(duì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民、獸醫(yī)加大蜱蟲(chóng)防控的宣傳力度，防止HGA 發(fā)生大規(guī)模暴發(fā)。

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