宋旭日，馮驚濤，2，邢微微，喻鑫玲

（1.岳陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，湖南岳陽(yáng)414000；2.湖南康潤(rùn)藥業(yè)有限公司，湖南岳陽(yáng)414000；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基因組工程研究室，北京100850；4.湖南省血吸蟲(chóng)病防治所免疫診斷研究室，湖南岳陽(yáng)414000）

日本血吸蟲(chóng)病是一種對(duì)人體健康危害嚴(yán)重、防治難度大、且影響范圍廣的寄生蟲(chóng)病，流行于我國(guó)、日本和菲律賓等地，其病原體是日本血吸蟲(chóng)（Schistosoma japonicum）。目前，由于缺乏對(duì)日本血吸蟲(chóng)病的簡(jiǎn)單且有效的診斷方法，我國(guó)基層血防單位仍主要采用Kato－Katz涂片糞檢法、毛蚴孵育法（MHT）等傳統(tǒng)病原學(xué)方法對(duì)日本血吸蟲(chóng)病進(jìn)行診斷［1］，這些方法不但費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且疫區(qū)群眾依從性低；更為重要的是，隨著吡喹酮的應(yīng)用，疫區(qū)群眾的感染率和感染度明顯下降，這些方法的敏感性也隨之下降，極易造成漏檢［1－2］，不利于日本血吸蟲(chóng)病的防治。

日本血吸蟲(chóng)的免疫類(lèi)檢測(cè)方法有皮試、尾蚴膜試驗(yàn)、環(huán)卵沉淀試驗(yàn)（COPT）、間接血凝試驗(yàn)（IHA）、多種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和直接免疫檢測(cè)等許多方法，這些方法或特異性不強(qiáng)、或敏感性不高等，限制了它們的應(yīng)用［1，3－4］。血吸蟲(chóng)核酸檢測(cè)是診斷血吸蟲(chóng)病潛在的優(yōu)良檢測(cè)方法，該類(lèi)方法不僅用時(shí)少、成本低，而且具有確診血吸蟲(chóng)病患者的意義。目前，以PCR 法或熒光定量PCR法為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增技術(shù)已被引入血吸蟲(chóng)診斷領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外均有相關(guān)報(bào)道。但是，PCR或熒光定量PCR 等方法對(duì)儀器設(shè)備和技術(shù)人員的要求相對(duì)都比較高，且結(jié)果判定也較為復(fù)雜，在基層血防單位難以推廣。而核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)儀器設(shè)備要求相對(duì)比較低、操作也比較簡(jiǎn)單［5－6］，為解決這一問(wèn)題提供了潛在的可能性。環(huán)介導(dǎo)核酸恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)是目前應(yīng)用比較廣泛的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)之一，本課題組開(kāi)發(fā)的“可視化日本血吸蟲(chóng)核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑”便是依托該技術(shù)的檢測(cè)體系，已經(jīng)在日本血吸蟲(chóng)感染性釘螺的檢測(cè)中獲得了良好的應(yīng)用。通過(guò)建立類(lèi)似的檢測(cè)體系，檢測(cè)經(jīng)日本血吸蟲(chóng)尾蚴感染的新西蘭大白兔等試驗(yàn)，探索可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)在日本血吸蟲(chóng)病篩查和診斷中應(yīng)用的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

日本血吸蟲(chóng)感染性釘螺、新西蘭大白兔由湖南省血吸蟲(chóng)病防治所提供。

1.2 方法

1.2.1 日本血吸蟲(chóng)感染兔模型建立和樣本采集

1.2.1.1 獲得日本血吸蟲(chóng)尾蚴 將30只感染性釘螺置于三角燒瓶里加水至瓶口1cm～2cm 處，瓶口放尼龍篩網(wǎng)防止釘螺爬出。等到尾蚴逸出至肉眼可見(jiàn)乳白一層后，用解剖針小心挑取尾蚴至蓋玻片上，解剖鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.1.2 用日本血吸蟲(chóng)尾蚴感染新西蘭大白兔 取2 kg左右的清潔級(jí)新西蘭大白兔21只，隨機(jī)分為7組，每組3只。第1組作為對(duì)照組，第2組～第7組用腹壁拔毛貼片法［7］分別感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴50、100、200、500、1 000、2 000 條。于 感 染 后 第7 天 和 第7周［8］，每只兔子各取血清1.5mL～2mL，于－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 兔血清或血漿中的基因組DNA 提取

1.2.2.1 NaOH 煮沸法 取兔血清或血漿50μL，加入等體積的100mmol／L NaOH，充分混勻，沸水浴30 min，水浴過(guò)程中，顛倒混勻混合液3～5次；水浴后，將樣本靜置冷卻，取上清10μL，用等體積的1mmol／L Tris－HCl（pH 8.0）中和，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 Qiagen試劑盒法 取兔血清或血漿500 μL，用試劑盒QIAamp DNA Blood Mini Kit抽提基因組DNA，操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取的基因組DNA于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 酚氯仿抽提法 取兔血清或血漿500μL，加 入1 000μL 提 取 緩 沖 液（0.15 mol／L NaCl、10 mmol／L EDTA、10 mmol／L Tris－HCl、2%的SDS、5μg／mL鮭魚(yú)精DNA、250μg／mL蛋白酶K，pH7.6），55℃下消化10min，等體積酚氯仿異戊醇（25∶24∶1）抽提2次，12 000r／min離心5min，棄上清，再用氯仿異戊醇（24∶1）抽提，12 000r／min離心5min，棄上清，加入1／10體積NaAc（3mol／L）和2倍體積冷無(wú)水乙醇，在－20℃下沉淀30min，12 000r／min離心10min，棄上清，常溫下750mL／L乙醇洗沉淀2次，第1次浸泡2h，第2 次浸泡30 min，并不時(shí)振蕩。12 000r／min離心5 min，棄上清，60℃溫箱干燥10 min，加20μL TE緩沖液溶解沉淀，于－20℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］。

1.2.2.4 TaKaRa 通用型快速試劑盒法 取兔血清或血漿500μL，用試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0抽提基因組DNA，操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取的基因組DNA于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的建立 引物設(shè)計(jì)：選定日本血吸蟲(chóng)特異性基因片段SJR2（AY027869），用軟件PrimerExplorer V4設(shè)計(jì)該基因的LAMP技術(shù)引物（內(nèi)引物F1P：GAT CAA TAG AGT CAA ACG CCG CCT TTC AGA CGC CCA ACA A，B1P：TTG AAA GGT GTA CCG GAG AAG TCC ATA AGC TCT AAC ACG ACA；外引物F3：GAC AGG TTC TGG AAC ATA GG，B3：GGT CAA TTC CGA AGA CAA TC），交由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

反應(yīng)體系建立：根據(jù)LAMP技術(shù)的特點(diǎn)，在PCR反應(yīng)管中加入10×ThermoPol Reaction buffer 2.5 μL，100mmol／L MgC21.5μL，dATP、dCTP和dGTP各1.4 mmol／L，dUTP 2.8 mmol／L，Betaine 0.8 mol／L，Calcein 0.05mmol／L，MnCl20.6mmol／L，引物F3和B3各0.4μmol／L，引物FIP 和BIP 各1.6 μmol／L，Uracil－DNA Glycosylase（1u／μL）0.5μL，Bst DNA Polymerase（8u／μL）1μL，待測(cè)樣本1μL，然后用雙蒸水補(bǔ)足至25μL／反應(yīng)體系。將上述反應(yīng)體系于37℃水浴2 min～15 min（根據(jù)產(chǎn)物污染情況而定），65℃水浴60min～90min（根據(jù)對(duì)試劑靈敏度要求而定），85℃滅活5min。陰、陽(yáng)性結(jié)果根據(jù)反應(yīng)體系的顏色變化判定。正常情況下，陰性結(jié)果的反應(yīng)體系顯示為棕黃色，陽(yáng)性結(jié)果的反應(yīng)體系顯示為熒光綠色。

1.2.4 主要試劑 Bst DNA Polymerase（Large fragment）、10×Thermo Pol reaction buffer和Magnesium sulfate solution（100mmol／L）購(gòu)自New England Biolabs公司；Tris－base、十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、Betaine和Calcein 購(gòu) 自Sigma 公 司；dATP、dCTP、dGTP、dUTP 和Uracil－DNA Glycosylase購(gòu)自Thermoscientific公司；蛋白酶K購(gòu)自Sigma公司；TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；QIAamp DNA Blood Mini Kit購(gòu)自Qiagen（德國(guó)）；引物購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 結(jié)果

2.1 NaOH 煮沸法抽提的兔血清或血漿中基因組DNA檢測(cè)結(jié)果

NaOH 煮沸法抽提的兔血清或血漿中基因組DNA經(jīng)可視化日本血吸蟲(chóng)核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑檢測(cè)，均為陰性結(jié)果，即便是500條以上血吸蟲(chóng)尾蚴感染組的新西蘭大白兔血清或血漿提取物也均未觀察到陽(yáng)性結(jié)果（圖1）。

2.2 Qigen試劑盒法抽提的兔血清或血漿中基因組DNA檢測(cè)結(jié)果

Qigen試劑盒法抽提的兔血清或血漿（第7天）中基因組DNA經(jīng)可視化日本血吸蟲(chóng)核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑檢測(cè)，陰性對(duì)照組和50條血吸蟲(chóng)尾蚴感染組為陰性結(jié)果，100條以上血吸蟲(chóng)尾蚴感染組為陽(yáng)性結(jié)果（圖2）。

2.3 酚氯仿法抽提的兔血清或血漿中基因組DNA檢測(cè)結(jié)果

酚氯仿法抽提的兔血清或血漿（第7天）中基因組DNA經(jīng)可視化日本血吸蟲(chóng)核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑檢測(cè)，陰性對(duì)照組和50條血吸蟲(chóng)尾蚴感染組為陰性結(jié)果，200條以上血吸蟲(chóng)尾蚴感染組為陽(yáng)性結(jié)果，100條血吸蟲(chóng)尾蚴感染組均為可疑陽(yáng)性結(jié)果（圖3）。

2.4 TaKaRa通用型快速試劑盒法抽提的兔血清或血漿中基因組DNA檢測(cè)結(jié)果

TaKaRa通用型快速試劑盒法抽提的兔血清或血漿（第7天）中基因組DNA 經(jīng)可視化日本血吸蟲(chóng)核酸檢測(cè)試劑檢測(cè)，陰性對(duì)照組、50、100和200條血吸蟲(chóng)尾蚴感染組為陰性結(jié)果，500條以上血吸蟲(chóng)尾蚴感染組為陽(yáng)性結(jié)果（圖4）。

圖1 可視化日本血吸蟲(chóng)核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑檢測(cè)NaOH煮沸法抽提的兔血清中基因組DNA 結(jié)果Fig.1 The detecting results of rabbit serum genomic DNA extracted by boiling method

圖2 可視化日本血吸蟲(chóng)核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑檢測(cè)Qiagen試劑盒法抽提的兔血清中基因組DNAFig.2 The detecting results of rabbit serum genomic DNA extracted by QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen）

圖3 可視化日本血吸蟲(chóng)核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑檢測(cè)酚氯仿法抽提的兔血清中基因組DNAFig.3 The detecting results of rabbit serum genomic DNA extracted by phenol chloroform method

圖4 可視化日本血吸蟲(chóng)核酸檢測(cè)試劑檢測(cè)TaKaRa通用型快速試劑盒法抽提的兔血清中基因組DNAFig.4 The detecting results of rabbit serum genomic DNA extracted by TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0

3 討論

在我國(guó)基層血防單位對(duì)日本血吸蟲(chóng)病的診斷仍主要采用傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷方法，不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且敏感度有限，容易造成漏檢，并且對(duì)于早期日本血吸蟲(chóng)病無(wú)效。隨著近年來(lái)吡喹酮的廣泛使用，血吸蟲(chóng)病呈現(xiàn)低感染度的流行趨勢(shì)，為敏感度有限的傳統(tǒng)病原學(xué)診斷提出了更為嚴(yán)厲的挑戰(zhàn)。其他的診斷方法包括免疫學(xué)診斷方法和核酸診斷方法等，免疫學(xué)診斷方法大多敏感性／特異性不夠強(qiáng)，核酸診斷方法大多儀器設(shè)備要求較高，且操作復(fù)雜，無(wú)法推廣使用。

本課題組 根 據(jù)LAMP 技 術(shù) 的 特 點(diǎn)［9－10］，開(kāi) 發(fā) 的可視化日本血吸蟲(chóng)核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑是一種儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單、操作容易、結(jié)果判定方便的檢測(cè)試劑，且特異性強(qiáng)，敏感性高（相對(duì)病原學(xué)診斷方法），已經(jīng)在日本血吸蟲(chóng)感染性釘螺的檢測(cè)中獲得了良好的應(yīng)用。本研究應(yīng)用該試劑對(duì)不同感染度的日本血吸蟲(chóng)感染兔進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)該試劑在日本血吸蟲(chóng)病的篩查和診斷等工作中應(yīng)用的可能性。該試劑的優(yōu)點(diǎn)是儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單、操作容易、結(jié)果判定方便等，但它必須結(jié)合良好的核酸提取方法組成完整的檢測(cè)試劑。目前，核酸提取工作多比較復(fù)雜，這將抵消該試劑的優(yōu)點(diǎn)，使該試劑無(wú)法在基層血防單位推廣使用。根據(jù)報(bào)道，將日本血吸蟲(chóng)感染性釘螺用NaOH 煮沸即可作為L(zhǎng)AMP試劑的DNA 模板［11］，因此本研究設(shè)計(jì)了NaOH 煮沸法提取血清中核酸。然而，即便是使用高感染度（500條以上血吸蟲(chóng)尾蚴感染）或感染后期（感染7周后）的新西蘭大白兔血清或者血漿，該檢測(cè)試劑也均未能檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果。究其原因，可能是血清或血漿中的血吸蟲(chóng)核酸片段數(shù)量非常有限，簡(jiǎn)單的NaOH 煮沸無(wú)法像煮沸釘螺那樣釋放足夠量的日本血吸蟲(chóng)DNA 模板。

為了進(jìn)一步觀察血清作為“可視化日本血吸蟲(chóng)核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑”的樣本的可能性，本研究分別用Qiagen試劑盒法和傳統(tǒng)的酚氯仿法［8］再次提取兔血清樣本中的基因組DNA 作為該試劑的模板。結(jié)果顯示，對(duì)100條以上日本血吸蟲(chóng)尾蚴感染的新西蘭大白兔血清，該試劑均可以檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果。然而，這兩種血清基因組DNA 提取方法操作都相對(duì)比較復(fù)雜，不適合在基層血防單位推廣使用。因此，本研究又選取了寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)的通用型基因組DNA 提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0）。該試劑盒操作相對(duì)簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)200條以下日本血吸蟲(chóng)尾蚴感染的新西蘭大白兔，卻未能檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果。本課題組還將繼續(xù)對(duì)此進(jìn)行研究。

總之，本研究初步探索了可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在日本血吸蟲(chóng)病的篩查和診斷中的應(yīng)用可能性。盡管本研究設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法（包括核酸提取和核酸擴(kuò)增檢測(cè)）暫未能檢測(cè)到低感染度新西蘭兔血清或者血漿中的日本血吸蟲(chóng)核酸片段，但隨著LAMP技術(shù)的進(jìn)步和核酸提取方法的不斷改進(jìn)，可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)憑借其儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單、操作容易、結(jié)果判定方便的優(yōu)勢(shì)，完全有可能在基層血防單位的日本血吸蟲(chóng)病篩查和診斷等工作中推廣應(yīng)用。

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